אנו מודים לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81672962), לקרן תוכנית החדשנות המחוזית של ג'יאנגסו ולקרן פרויקט המפתח המשותף של אוניברסיטת דרום מזרח והאוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג על תמיכתם.

דגימת GBM נרכשה ממטופל במהלך ניתוח שגרתי לאחר שקיבלה הסכמה מדעת מלאה על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג.
1. בידוד ותרבות של GSCs שמקורם בחולים
<ol><li>מניחים רקמת גליובלסטומה טרייה שנקטפה בניתוח בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל מל?...

<ol>
	<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li><li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+stem+cells:+a+novel+framework+for+brain+tumors.">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li><li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells.">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li><li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combenefit:+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations.">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance.">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li><li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV.">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li><li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4/6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer.">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li><li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer.">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752 (2019).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring.">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors.">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li></ol>

במחקר הנוכחי תואר פרוטוקול שניתן ליישם כדי לזהות טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות GSCs שמקורם במטופל. שלא כמו המודל המדדי הסטנדרטי של סינרגיה/תוספות כגון Loewe, BLISS או HSA, נעשה שימוש בזרימת עבודה פשוטה ומהירה שאינה דורשת שילוב של זוג תרופות בריכוזים מרובים באופן פקטורלי מלא כשיטות המסורתי?...

גליובלסטומה (GBM) הוא הסוג הנפוץ והאגרסיבי ביותר של גידול ראשוני במוח. נכון לעכשיו, ההישרדות הכוללת של חולי GBM שקיבלו טיפול מקסימלי (שילוב של ניתוח, כימותרפיה והקרנות) עדיין קצרה מ -15 חודשים; אז טיפולים חדשניים ויעילים עבור GBM נדרשים בדחיפות.
נוכחותם של תאי גזע גליומה (GSCs) ב- GBM מהווה אתגר ניכר לטיפול הקונבנציונלי שכן תאים דמויי גזע אלה ממלאים תפקידי מפתח בשמירה על מיקרו-סביבה של גידול, עמידות לתרופות והישנות גידול1. לכן, מיקוד GSCs יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול GBM2. עם זאת, חיסרון משמעותי ליעילות התרופה ב- GBM הוא אופיה ההטרוגנטי, כולל אך לא רק ההבדל במוטציות גנטיות, תת-סוגים מעורבים, ויסות אפיגנטי ומיקרו-סביבה של גידולים מה שהופך אותם עקשניים מאוד לטיפול. לאחר ניסויים קליניים כושלים רבים, מדענים וחוקרים קליניים הבינו כי טיפול ממוקד סוכן יחיד הוא כנראה מסוגל שליטה מלאה על ההתקדמות של סרטן הטרוגניים מאוד כגון GBM. בעוד, שילובי תרופות שנבחרו בקפידה אושרו ליעילותם על ידי שיפור סינרגטי את ההשפעה אחד של השני, ובכך לספק פתרון מבטיח לטיפול GBM.
למרות שיש דרכים רבות להעריך את האינטראקציות בין תרופתיות של שילוב סמים, כגון CI (אינדקס קומבינציה), HSA (הסוכן הבודד הגבוה ביותר) וערכי בליס וכו'3,4, שיטות חישוב אלה מבוססות בדרך כלל על שילובי ריכוז מרובים. אכן, שיטות אלה יכולות לספק הערכה חיובית של אינטראקציה בין סמים לתרופות, אך יכולות להיות מייגעות מאוד אם הן מיושמות בהקרנת תפוקה גבוהה. כדי לפשט את התהליך, זרימת עבודה סינון לזיהוי מהיר של שילובי תרופות פוטנציאליים המעכבים את הצמיחה של GSCs שמקורם ביופסיות כירורגיות של GBM החולה פותח. מדד רגישות (SI) המשקף את ההבדל של האפקט המשולב הצפוי ואת האפקט המשולב שנצפו הוכנס לשיטה זו כדי לכמת את ההשפעה הסינרגית של כל תרופה, כך המועמדים הפוטנציאליים ניתן לזהות בקלות על ידי דירוג SI. בינתיים, פרוטוקול זה מדגים מסך לדוגמה כדי לזהות את המועמדים הפוטנציאליים שיכולים לסנן את אפקט האנטי-גליומה עם טמוזולומייד, הכימותרפיה בשורה הראשונה לטיפול GBM, בין 20 מעכבים מולקולריים קטנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluta Max</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>P: 10,000 units/ml&#160;&#160;&#160;&#160; S:&#160; 10,000 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2088876</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 1. The&#160;formulation&#160;of GSC&#160;complete culture medium.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABT-737</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective and BH3 mimetic&#160;Bcl-2,&#160;Bcl-xL&#160;and&#160;Bcl-w&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adavosertib (MK-1775)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Wee1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZD5991</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Potent inhibitor of TGF-&#946; type I receptor&#160;ALK5 kinase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP57380</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent&#160;MNK1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dactolisib (BEZ235)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Dual ATP-competitive&#160;PI3K&#160;and&#160;mTOR&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dasatinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Dual&#160;Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR&#160;tyrosine kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gefitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>EGFR tyrosine kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linifanib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of&#160;VEGFR&#160;and&#160;PDGFR&#160;family</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masitinib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Inhibitor of&#160;c-Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML141</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Non-competitive inhibitor of&#160;Cdc42 GTPase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSI-930</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;CDK4&#160;and&#160;CDK6&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 202190</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;p38 MAP kinase&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepantronium bromide (YM-155)</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Survivin&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS 359</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Potent FLT3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMI-77</td>
			<td>MCE</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;Mcl-1&#160;inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td></td>
			<td>Selective&#160;estrogen receptor (ER)&#160;modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid screening workflow to identify potential combination therapy for gbm using patient-derived glioma stem cells

תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג'ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.

תאי XG387 יצרו נוירוספירות במדיום התרבותי המתואר בטבלה 1 בצלחת תרבות אולטרה-נמוכה של 6 בארות או בצלחת לא מצופה5 (איור 1A). ראשית, בוצעה בדיקה כדי לבדוק אם עוצמת הביו-אור מתאי XG387-Luc הייתה פרופורציונלית למספר התא. כפי שניתן לראות באיור 1B, עוצמת...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells at JoVE.com

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

תאי גזע גליומה הם תת-אוכלוסייה של תאים בליומה, אשר בדרך כלל עמידים לכימותרפיה והקרנות. כאן תיארנו את השיטה לזיהוי מהיר של טיפולים משולבים, מיקוד תאי גזע גליומה, במקום תאי גליומה מובחנים. בהשוואה לשיטות אחרות, אשר עשוי להיות מייגע ומסובך.פרוטוקול זה הוא פשוט ומהיר יחסית, כדי לזהות שילובי סמים שימושיים פוטנציאליים. התחל על ידי איסוף תאי גזע גליומה או GSCs ממדיום התרבות, ו centrifuging אותם ב 70 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, לעכל את התאים עם accutase במשך ארבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בעזרת קצה של 200 מיקרוליטר, מעבירים את התאים שוב ושוב כדי לנתק, ומציבים מחדש את גלולה התא. הוסף את GSCs בצפיפות של 200, 000 תאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות, לתוך כל באר של צלחת תרבות 12 היטב, ודגר אותם בן לילה. למחרת, להוסיף 30 microliters של לוציפראז-eGFP וירוס supernatant לתוך כל באר של הצלחת.צנטריפוגות התאים ב 1000 פעמים G במשך שעתיים, ב 25 מעלות צלזיוס ולדגירה אותם בן לילה. למחרת, להחליף את המדיום בבארות על ידי איסוף GSCs, centrifuging אותם, הסרת supernatant, שימוש חוזר אותם במדיום טרי, ותליכתם מחדש. תרביתי את התאים לעוד 48 שעות.שים לב ללוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאשר את המראה של תאים חיוביים GFP. מיין ואסוף את GSCs עם פלואורסצנטיות גבוהה באמצעות ממיין תאי זרימה ותרבות אותם עוד יותר. מעיל, 96 לוחות תחתית אופטיים היטב עם תערובת מטריצה חוץ תאית, כגון מטריגל, ודגרה אותם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.הסר את התערובת עודפת בעדינות לשטוף את הצלחות פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן זרע XG387-לוק תאים בצפיפות של 1000 תאים ב 100 microliters של מדיום תרבות, ולכל באר של לוחות מצופים ותרבות אותם בן לילה. למחרת, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את ההתקשרות שלהם לצלחת. לאחר מכן להכין פתרון טמוזולומייד 200 מיקרומולר ושני פתרונות מיקרומולרים של הסוכנים הממוקדים, במדיום תרבות.עבור הקרנת תרופות משולבת, להסיר את המדיום הריק ולהוסיף את המדיום המכיל או 200 טמוזולומייד מיקרומולארי או שני סוכן ממוקד micromolar, או שילוב של שניהם, לתוך כל באר עבור שלושה שכפולים טכניים לטיפול. לדגור את הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. צלם תמונות של הביולומינציה התאית בצלחת באמצעות מערכת ההדמיה בספקטרום IVIS.באמצעות התוכנה המובנית, ליצור אזורים מעגליים מרובים של אזור העניין ולכומת את הביולומינציה התאית. כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים שיכולים לשפר את אפקט האנטיגליובלסטומה של טמוזולומייד, 20 מעכבי מולקולות קטנות סלקטיביות המטרה נותחו באמצעות הקרנת שילוב תרופות. ערכי המדד הרגישים של 13 סוכנים ממוקדים היו מעל לאפס וחמישה מהם היו מעל 0.1.המדד הרגיש של שתי התרופות המובילות UMI-77 ו- A 83-01, היו גבוהים מ-0.25, מה שמצביע על הפוטנציאל שלהם להתמזמז עם טמוזולומייד. הטיפול המשולב של temozolomide ו UMI-77 הוערך באמצעות תיעוב אנטי-הפצה בשש על שש מנות טיטריון מטריצה. ערכי אינדקס השילוב היו פחות מאחד.וערכי הסוכן הבודד הגבוהים היו גדולים מאפס עבור רוב השילובים של טמוזולומייד ו- UMI-77 בריכוזים שונים. מציע אינטראקציה סינרגטי הכוללת של טמוזולומייד ו- UMI-77 הן ב- XG387 והן ב- XG328 GSCs. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם במציאת שילוב סמים באמצעות תאים סרטניים דבקים פשוט על ידי הסרת שלב ציפוי הצלחת.