Tak til Dr. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach og Alison L. Sankey for deres hjælp til at udføre dette arbejde. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium. USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Defense Advanced Research Projects Agency # HR0011-16-2-0019 til Gene E. Robinson og Huimin Zhao, USDA projekt 2030-21000-001-00-D, og Phenotypic Plasticity Research Experience for Community College Studerende ved University of Illinois i Urbana Champaign.

1. QMC-samling
<ol><li>QPC'er fra dele (Figur 1A) med en enkelt æglægningsplade (ELP) indsat som vist i figur 1B. Tilsættes ikke feederrør, før arbejderne er blevet tilsat til buret. Dæk midlertidigt de 4 feeder huller med laboratoriekvalitetstape.</li>
	<li>Indsæt dronningens ekskluder og fodringskammerdøren over fodringskammeret for at forhindre dronningen i at komme ind i fodringskammeret og kontakte den behandlede kost. Se Fine et al.<sup class="xr...

Fecundity af kvindelige ensomme insekter samt dronninger i eusociale insektkolonier kan påvirkes af abiotiske stressorer som agrokemikalier25,28,29,30,33. Hos honningbier kan virkningerne af agrokemikalier på dronninger være indirekte, da de kan forekomme gennem ændringer i deres pleje og fodring af arbejderbier. Vores repræsentative resultater, som svare...

På grund af den øgede globale efterspørgsel efter landbrugsprodukter kræver moderne landbrugsmetoder ofte brug af agrokemikalier til at kontrollere mange skadedyr, der vides at reducere eller skade høstudbyttet1. Samtidig er producenterne af mange frugt-, grøntsags- og nøddeafgrøder afhængige af bestøvningstjenesterne fra kommercielle honningbikolonier for at sikre rigeligt høstudbytte2. Denne praksis kan resultere i, at bestøvere, herunder honningbier (Apis mellifera), udsættes for skadelige niveauer af pesticidrester3. Samtidig kræver den udbredte tilstedeværelse af parasitære Varroa-destructormideangreb i honningbikolonier ofte biavlere til at behandle deres bistader med miticider, hvilket også kan have negative virkninger på koloniens sundhed og levetid4,5,6. For at reducere og afbøde skadelige virkninger af agrokemiske produkter er det nødvendigt at evaluere deres sikkerhed fuldt ud for honningbier forud for deres gennemførelse, så der kan fremsættes anbefalinger til deres anvendelse for at beskytte gavnlige insekter.
I øjeblikket er Environmental Protection Agency (EPA) afhængig af en differentieret risikovurderingsstrategi for eksponering af honningbi pesticid, som involverer laboratorieundersøgelser på voksne bier og undertiden honningbilarver7. Hvis laboratorieundersøgelser på lavere niveauer ikke mindsker bekymringerne om toksicitet, kan det anbefales at teste højere niveau og semifelttest. Mens disse laboratorieundersøgelser giver værdifuld indsigt i de potentielle virkninger af agrokemikalier på arbejdernes levetid, er de ikke nødvendigvis forudsigende for deres virkninger på dronninger, som adskiller sig væsentligt fra arbejdere biologisk8 og adfærdsmæssigt9. Desuden er der mange potentielle virkninger af agrokemikalier på insekter ud over dødelighed, hvilket kan have betydelige konsekvenser for sociale insekter, der er afhængige af koordineret adfærd for at fungere som en kolonienhed10,11.
Selvom dødelighed er den mest almindeligt betragtede effekt af agrokemiske pesticider12, kan disse produkter have en bred vifte af virkninger på både mål- og ikke-mål leddyr, herunder ændret adfærd13,14,15,16, repellency eller attractancy17,18,19, ændringer i fodringsmønstre20,21,22 og forhøjet eller nedsat fecundity20,21,22,23,24,25. For sociale insekter kan disse virkninger systemisk forstyrre koloniinteraktioner og funktioner11. Af disse funktioner kan reproduktion, som er stærkt afhængig af en enkelt æglægningsdronning støttet af resten af kolonienheden9, være særligt sårbar over for forstyrrelser på grund af pesticideksponering.
Undersøgelser udført på umodne dronninger har vist, at udviklingsmæssig eksponering for miticider kan påvirke voksen dronning adfærd, fysiologi, overlevelse26,27. Tilsvarende har undersøgelser, der anvender kolonier i fuld eller reduceret størrelse , vist , at agrokemikalier kan påvirke voksne honningbidronninger ved at reducere parringssucces28, faldende oviposition29og reducere levedygtigheden af de producerede æg25,30,31. Disse fænomener har tidligere været vanskelige at observere uden brug af hele kolonier, hovedsagelig på grund af mangel på tilgængelige laboratoriemetoder. Men en metode til at studere dronning oviposition under stramt kontrollerede laboratorieforhold ved hjælp af Queen Monitoring Cages (QMC)32 er for nylig blevet tilpasset til at undersøge virkningerne af agrokemikalier på dronning fecundity33. Her er disse teknikker beskrevet i detaljer sammen med yderligere metoder til at måle og spore arbejdstager kost forbrug i QPC'er.
Disse metoder er mere fordelagtige end eksperimenter, der kræver kolonier i fuld størrelse, fordi de giver mulighed for administration af præcise doser af agrokemikalier til et stærkt reduceret antal arbejdere i forhold til de titusinder, der typisk er til stede inde i en koloni34, som derefter giver dronningen. Denne eksponeringsteknik afspejler den brugte eksponering, som dronninger ville opleve i virkelige scenarier, fordi dronninger i en koloni ikke fodrer sig selv og stoler på, at arbejderne giver dem kost9. Tilsvarende forlader dronninger generelt ikke bikuben undtagen under koloni reproduktion (swarming) til parring flyvninger35. Parret honningbi dronninger kan købes fra kommercielle dronning opdrættere og sendes natten over. Typisk sælger dronningeopdrættere dronninger direkte efter at have bekræftet, at de er begyndt at lægge æg, hvilket er taget som en indikation af vellykket parring. Hvis der er behov for mere præcise oplysninger om dronningealderen eller relatedness, kan forskerne rådføre sig med dronningeopdrætteren, før de afgiver en ordre.
QPC'er giver mulighed for præcis observation og kvantificering af honningbi dronning oviposition og æg udklækning satser32,33, giver værdifulde data relateret til virkningerne af agrokemisk eksponering på dronning fecundity. De repræsentative resultater, der præsenteres her, beskriver et eksperiment, der kvantificerer oviposition, kostforbrug og embryons levedygtighed i QPC'er under kronisk eksponering for feltrelevante koncentrationer af det systemiske neurotoksiske neonicotinoide pesticid imidacloprid36. Når det er anvendt, translokerer imidacloprid til plantevæv37, og rester er blevet påvist pollen og nektar af mange bibestøvede planter38,39,40. Eksponering for imidacloprid kan have en bred vifte af skadelige virkninger på honningbier , herunder nedsat fourageringsevne16, nedsat immunfunktion41og nedsat koloniudvidelse ogoverlevelseshastighed 42,43. Her blev imidacloprid udvalgt til brug som teststof, fordi feltforsøg har vist, at det kan påvirke honningbidronningen29

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluon</td>
			<td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td>
			<td>2871A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honey bee queens</td>
			<td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>37894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaBee Powder</td>
			<td>MegaBee, San Dieago, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>02-682-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 20 gauge</td>
			<td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td>
			<td>5FVK4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>P0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Queen Monitoring Cages</td>
			<td>University of Illinois Urbana-Champaign</td>
			<td></td>
			<td>Patent application number: 20190350175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Microplate Lids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>5500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing agrochemical risk to mated honey bee queens

De nuværende risikovurderingsstrategier for honningbier er stærkt afhængige af laboratorieundersøgelser udført på voksne eller umodne arbejderbier, men disse metoder kan ikke nøjagtigt registrere virkningerne af agrokemisk eksponering på honningbidronninger. Som den eneste producent af befrugtede æg inde i en honningbikoloni er dronningen uden tvivl det vigtigste enkeltmedlem af en fungerende kolonienhed. Derfor bør det betragtes som et kritisk aspekt af vurderingen af pesticidrisikovurderingen at forstå, hvordan agrokemikalier påvirker dronningens sundhed og produktivitet. Her præsenteres en tilpasset metode til at udsætte honningbidronninger og arbejderedronningspersonale for agrokemiske stressorer, der administreres gennem en arbejdstagerdiæt, efterfulgt af sporing af ægproduktion i laboratoriet og vurdering af første instar eclosion ved hjælp af et specialiseret bur, kaldet et queen monitoring cage. For at illustrere metodens tilsigtede anvendelse beskrives resultaterne af et eksperiment, hvor arbejderedronning ledsagere blev fodret med kost, der indeholder fremlejede doser af imidacloprid og virkninger på dronninger.

Produktionen af æg blev overvåget i QMCs samlet og vedligeholdt som beskrevet ovenfor med en gang daglige observationer af ægproduktion og 15 bure pr. behandlingsgruppe. Nyligt parret dronninger af primært Carniolan lager blev købt og afsendt natten fra en dronning opdrætter, og honningbi arbejdstagere blev opnået fra 3 kolonier vedligeholdes i henhold til standard kommercielle metoder på The Bee Research Facility på University of Illinois Urbana-Champaign. Her blev der anvendt 4 diætbehandlingsgrupper: 1) 50 p...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens at JoVE.com

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Denne protokol blev udviklet for at øge forståelsen af, hvordan agrokemikalier påvirker honningbi (Apis mellifera) reproduktion ved at etablere metoder til at udsætte honningbi dronninger og deres arbejdstager viceværter til agrokemikalier i en kontrolleret, laboratorium indstilling og omhyggeligt overvågning af deres relevante svar.

Vurdering agrokemisk risiko for parrede honningbi dronninger

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Agrokemisk eksponering kan have store konsekvenser for alle medlemmer af en honningbikoloni, herunder det vigtigste medlem, dronninger. Men indtil for nylig har få værktøjer været tilgængelige til at studere disse virkninger. Denne teknik gør det muligt for forskere at udsætte dronninger for agrokemikalier under kontrollerede forhold, der simulerer forhold, de måtte opleve på området.Det er ret nemt at forstyrre honningbi dronning æglægning adfærd, så det er vigtigt at passe på, når håndtering af arbejdstagere og dronninger før og under eksperimentet. Viser disse procedurer vil være, Amy Floyd og Eliza Litsey, laboranter på invasive arter og bestøver Health Research Unit, Honeybee Research Lab. Til at begynde med skal du samle dronningovervågningsbure eller QPC'er ved at indsætte dørpanelerne og derefter indsætte dronningens ekskluder i fodringskammerdøren over fodringskammeret for at forhindre dronningen i at komme ind og kontakte den behandlede kost.Indsæt en enkelt elp. Tilsæt ikke feederrør, før arbejderne er blevet tilsat til buret, og dæk midlertidigt de fire feederhuller med laboratoriekvalitetstape. Efter indsamling og inkubation af vokskammerammerne, der indeholder den kappeklædte arbejderyngel fra honningbikolonier, skal du børste de lukkede bier ud i en åben beholder foret med en insektbarrieremaling for at forhindre bierne i at kravle ud.Tilsæt mindst 50 bier efter vægt til æglægningskammeret i hvert QMC. For at sikre, at en forskelligartet genetisk pool indføres, opnå lignende antal arbejdstagerbier fra mindst tre kolonier, og give dem mulighed for at blande før tilsætning af bier til QMCs. Tilsæt fødefodere, der indeholder saccharoseopløsning, vand og pollentilskud.Brug dronninger købt fra en kommerciel opdrætter inden for 48 timer efter modtagelsen. Mens dronningen stadig er inde i forsendelsesburet, skal du placere den i en klar plastikpose. Placer derefter den ene ende af et plastikrør, der er forbundet til en kuldioxidgasbeholder inde i posen, og åbn forsigtigt beholderventilen for at tillade kuldioxidgas at strømme.Når posen er oppustet med gas, skal beholderventilen samtidig lukkes og holde posen lukket for at fange gassen inde. Hold posen lukket i 30 sekunder, eller indtil dronningen er holdt op med at bevæge sig. Fjern dronningen ved at åbne forsendelsesburet, når dronningen observeres at være bevidstløs.Åbn delvist døren til æglægningskammeret, placer forsigtigt den bevidstløse dronning inde og luk låget. Føj den anden elp til hver QMC. Placer et stykke laboratorietape over toppen af de to ELP'er for at forhindre dem i at adskille sig fra QMC-rammen, og forhindre arbejdere i at forlade buret.Placer burene i en mørk inkubator med stabile miljøforhold på 34 til 35 grader celsius og 50-70% relativ luftfugtighed. For at administrere kosten snøret med agrokemikalier skal du forberede lageropløsningerne af agrokemikalier i et passende opløsningsmiddel, såsom acetone, i en koncentration, der kan føjes til kosten for at opnå den ønskede endelige koncentration af den agrokemiske af interesse. Administrere agrokemiske behandlinger i en saccharose opløsning, en kommerciel pollen supplement, eller begge dele.Forbered den eksperimentelle kost til brug på samme dag ved at tilføje en passende mængde lageropløsning til kølet eller stuetemperatur, 50% saccharoseopløsning. Bland grundigt ved at hvirvler med en medium hastighed. For pollen kosttilskud, tilføje en beregnet mængde agrokemikalier lageropløsning til saccharose opløsning, og vortex grundigt, før du tilføjer det til pulveriseret supplement.Tilføj kost til feeder rør og registrere feeder vægte før du placerer dem i QMC. For at kvantificere æglægningen skal du begynde med at fjerne QPC'er fra inkubatoren. Undersøg bagsiden af de klare ELP'er, hvis æg er til stede, fjern dørpanelet foran pladen af interesse.Fjern båndet fra den anden side af ELP'erne, og skub dørpanelet mellem ELP og bierne inde i QMC' en. Med dørpanelet på plads skal du fjerne ELP og tælle og registrere antallet af æg inde i ELP-cellerne. Fjern æggene ved at trykke på kanten af ELP open-cell-side ned, på en hård overflade.Når æggene falder ud, skal du udskifte den tomme ELP i QMC. Fjern og udskift forsigtigt dørpanelet bag ELP'en på ydersiden af QMC' en. Gentag efter behov med den anden ELP og udskift båndet på tværs af QMC, når det er færdigt.For at overvåge fødevareforbruget skal du erstatte maden med en frisklavet kost hver anden dag. Forbered nye feeder rør og veje dem, før du starter ægproduktion overvågningsaktiviteter. Byt gamle rør med nye, og veje gamle rør, før bortskaffelse af dem.Sammenlign den endelige vægt af feederrøret og ubesvaret kost med vægten af det samme rør for at estimere kostforbruget. Kontroller en gang om dagen for at sikre, at fødefodere aldrig er tomme. Hvis et feederrør er tomt eller nær tomt, skal du fjerne det, genopfylde det, registrere rørets vægt før og efter og tilføje forskellen til det samlede to-dages diætforbrug for QMC.På et udvalgt tidspunkt under et QMC-eksperiment skal du fjerne ELP'erne, der indeholder frisklagte æg, fra QMC som beskrevet tidligere, men fordrive æggene ikke fra ELP. Dæk ELP først med en PCR pladeforsegling, og derefter et universelt mikropladelåg, og placer det inde i en udtørrer med en mættet kaliumsulfatopløsning. Vurder udklækningsraterne ca. 78 timer efter fjernelse af ELP'er fra QMC.En C-formet larve i bunden af cellen er tegn på en vellykket udklækningshændelse. Hvis QPC'erne var blevet befolket med overskydende arbejdere, skal du udtage prøver af arbejderbierne på et valgt tidspunkt under forsøget for at vurdere de behandlingsbetingede ændringer i deres fysiologi. Før prøveudtagning skal du placere et dørpanel mellem en ELP og det indre af QMC og fjerne ELP.Løft forsigtigt dørpanelet ca. 0,5 centimeter fra bunden af buret, og fjern en arbejderbi inde fra QMC ved hjælp af fjervægts pincet. Til genekspression analyse, snap fryse bierne i flydende nitrogen og gemme dem på 80 grader Celsius. Bevar den indsamlede bi til opfølgningsanalyse, og gentag denne proces, indtil det ønskede antal prøver er indsamlet.Kosten imidacloprid behandling-relaterede ændringer i daglige æg tæller blev evalueret ved at gennemføre en Poisson log lineær generaliseret estimering ligning, med en auto-regressiv korrelation matrix. Daglig ægproduktion var betydeligt lavere i QMCs givet pollentilskud og saccharose indeholdende 50 dele per milliard imidacloprid. Der blev observeret en dosisafhængig effekt på det samlede antal æg, der produceres i hvert QMC til imidacloprid behandlinger, der administreres i både saccharose og pollentilskud.Med den største reduktion observeret i QMCs fodret 50 dele-per-milliard imidacloprid, efterfulgt af 10 dele-per-milliard i pollen supplement plus saccharose. Der blev ikke observeret nogen forskel i de samlede producerede æg mellem kontrol og QPC'er, der blev fodret med 10 dele pr. milliard imidacloprid og pollentilskud alene. Pollentilskud, vand og saccharose forbrug blev registreret hver 48 timer i 10 eller 12 dage.Daglige satser for saccharose forbrug steg betydeligt som eksperimentet skred frem, men satser for pollen supplement forbrug faldt. Højere satser for pollenforbrug blev observeret, når 10 dele-per-milliard imidacloprid blev administreret i pollen supplement alene. Og satsen faldt, når 10 eller 50 dele-per-milliard blev administreret i pollen supplement og saccharose opløsning sammen.Brug af daggamle bier er afgørende for at sikre dronningens accept og for at reducere arbejderen over genaktivering. Også kritisk er den omhyggelige håndtering af dronningen og for at holde burene i et stabilt miljø.