Авторы хотели бы поблагодарить Отдел ресурсов лабораторных животных в Университете Дьюка и их команду по разведения за их помощь и большую заботу, оказанную животным. Кроме того, авторы хотели бы отметить команду PhotoPath в отделе патологии за их помощь с аудио- и видео-частями рукописи. Эта работа была поддержана дискреционными исследовательскими фондами лаборатории Staats.

Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с политикой Университета Дьюка IACUC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые материалы приведены в Таблице материалов.
1. Зеодация и анестезия кроликов
<ol><li>Седовать самку кролика (половозрелого; примерно 5-30 ...

Хотя это и не описано в приведенном выше протоколе, успешное разведение кроликов необходимо для этой материнской модели и для сбора молока. Кроликов легко разводят по живому укрытию в исследовательской обстановке. Рекомендуется, чтобы его перевели в клетку бакса для размножения, так к?...

Исследования материнской иммунизации и переноса антител имеют неоценимое значение по многим причинам, так как это начальный путь передачи иммунитета и последующей защиты от патогенов и заболеваний у новорожденных и младенцев. Иммунизация матерей может оказать положительное влияние как на здоровье матери, так и ребенка/ребенка на глобальном уровне путем снижения заболеваемости и смертности, связанных с определенными патогенами, в течение этого уязвимого периода1. Основной целью этой стратегии является повышение уровня специфических материнских антител на протяжении всей беременности. Эти антитела затем могут быть переданы новорожденному и младенцу на уровнях, достаточных для защиты от инфекций, пока их иммунная система не станет достаточно зрелой, чтобы адекватно реагировать на проблемы1,2,3. Предыдущая работа показала, что более высокие титры антител при рождении связаны либо с полной защитой, либо с отсроченным началом и уменьшением тяжести многочисленных различных инфекционных заболеваний у новорожденных, включая столбняк, коклюш, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), грипп и стрептококковые инфекции группы В1,2,3.
У людей материнские антитела пассивно переносятся через плаценту, а также передаются через грудное молоко через кормление грудью. Предыдущая работа показала, что ВИЧ-специфические уровни IgA в грудном молоке человека от матерей, инфицированных вирусом, были связаны с уменьшением постнатальной передачи вируса, что предполагает защитную роль грудного молока против ВИЧ IgA4. Исследования на нечеловеческих приматах показали, что иммунизация против ВИЧ может вызывать значительный ответ антител в грудном молоке, и хотя аналогичные сывороточные ответы IgG были индуцированы после системной иммунизации по сравнению с иммунизацией слизистой оболочки, иммунизация слизистой оболочки вызвала значительно более высокий ответ IgA в молоке5,6.
При выявлении трансляционно подходящей животной модели для этих исследований следует учитывать тип плацентации и механизмы пассивного переноса антител, а также перенос антител через грудное молоко. Существует три основных типа плацентации у млекопитающих, основанных на типах тканей и слоях на границе матери и плода, включая гемохориальную (приматы, грызуны и кролики), эндотелиохориальную (плотоядные) и эпителиохориальную (лошади, свиньи и жвачные животные). Гемохориальная плацента является наиболее инвазивным типом, позволяющим осуществлять прямую связь между материнским кровоснабжением и хорионом или самой внешней плодной оболочкой. Исходя из количества слоев трофобластов, существует несколько вариаций гемохориальной плацентации, включая гемомонохориальную плаценту, обнаруженную у приматов, гемодихориальную плаценту у кроликов и гемотрихориальную плаценту, наблюдаемую у крыс и мышей7. Этот прямой контакт между материнским кровоснабжением и хорионом позволяет пассивно передавать антитела через плаценту во время беременности. IgG является единственным классом антител, который значительно пересекает человеческую плаценту8,тогда как IgA является преобладающим классом Ig, обнаруженным в грудном молоке человека9. Из научно значимых моделей только приматы (включая человека), кролики и морские свинки переносят IgG в утробе матери и IgA в молоке10,11. Таким образом, модель кролика включает факторы, сопоставимые с теми, которые у людей контролируют трансплацентарный перенос IgG и лактационный перенос IgA.
В дополнение к тому, что они служат исключительной моделью для материнского иммунитета и разработки вакцины, сходство между полостями носа кролика и человека делает их подходящей моделью для интраназальной иммунизации. Объем носовой полости кролика больше похож на человеческие, чем на модели грызунов, основанные на относительной массе тела12. Кроме того, Casteleyn et al. 12 продемонстрировали, что носовая ассоциированная лимфоидная ткань (NALT) более объемна у кролика по сравнению с грызунами. NALT расположен в основном в вентральном и вентромедиальном аспекте вентрального носового мяса и в боковом и дорсолатеральном аспекте носоглоточного мяса у кроликов, тогда как у грызунов лимфоидная ткань присутствует только вдоль вентрального аспекта носоглоточного мяса12. У кроликов строение и расположение интраэпителиальных и ламина проприальных лимфоцитов, а также выделенных лимфоидных фолликулов аналогичны человеческим12.
Дополнительные преимущества использования кролика в качестве модели материнского и слизистого иммунитета включают их высокую плодовитость и относительно короткий срок беременности. Крупные ушные кровеносные сосуды обеспечивают относительно легкий доступ к большим объемам крови для серийных сборов. Для анализа реакции антиген-специфических антител могут быть собраны различные образцы слизистой оболочки, включая грудное молоко13 (при кормлении), слизистые выделения или промывки (например, пероральные14,15,16,бронхоальвеолярный лаваж13,17,18,19,влагалищ20,21,22)и кал20,23,24,25. Образцы молока могут быть легко собраны во время лактации для оценки наличия антиген-специфических реакций антител. Хотя это не так распространено, как для людей и мышей, широкий спектр экспериментальных реагентов доступен для исследований и анализов, специфичных для кроликов. В этой статье мы опишем и продемонстрируем интраназальную иммунизацию и сбор молока у новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Intranasal Immunization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine/Vaporizer</td>
			<td>Vet Equip</td>
			<td>901807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle (25 g)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>07-806-7584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (250 mL Bottle)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Syringe (1 mL)</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>07-892-7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucosal Vaccine</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Experimental Vaccine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose Cone</td>
			<td>McCulloch Medical</td>
			<td>07891-1097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53503-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PromAce (Acepromazine maleate)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>07-893-5734</td>
			<td>1mg/kg IM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Sterile Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>07-888-2572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk Collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep 2-ply</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>07-839-8871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine/Vaporizer</td>
			<td>Vet Equip</td>
			<td>901807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needles (25 g)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>07-806-7584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (250 mL Bottle)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Syringe (1 mL)</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>07-892-7410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponge (4x4)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>07-891-5815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nose Cone</td>
			<td>McCulloch Medical</td>
			<td>07891-1097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PromAce (Acepromazine Maleate)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>07-893-5734</td>
			<td>1mg/kg IM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Sterile Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>07-888-2572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Conical Vial (15 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal immunization and milk collection in studies of maternal immunization in new zealand white rabbits (oryctolagus cuniculus)

Благодаря сходству плацентации и переноса антител с человеком, кролики являются отличной моделью материнской иммунизации. Дополнительными преимуществами этой исследовательской модели являются простота размножения и сбора образцов, относительно короткий период беременности и большие размеры помета. Обычно оцениваемые пути иммунизации включают подкожные, внутримышечные, интраназальные и внутрикожные. Нетерминальный отбор проб для хронологического выявления иммунологических реакций на эти иммунизации включает сбор крови, как из плотин, так и из наборов, и молока из лактирующих. В этой статье мы продемонстрируем методы, которые наша лаборатория использовала в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов(Oryctolagus cuniculus),включая интраназальную иммунизацию и сбор молока.

Обзор типичного дизайна исследования интраназальной иммунизации матери изображен на рисунке 1,включая иммунизацию, разведение, расщепление, лактацию и перенос антител. Хотя это и не проиллюстрировано, кровь должна быть собрана до первоначальной иммунизации для исходн...

Watch this Scientific Journal Video about Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus at JoVE.com

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits Oryctolagus cuniculus

В данной статье описано и демпсесса введение интраназальных вакцин и забор молока у лактирующих кроликов(Oryctolagus cuniculus)в качестве средства оценки иммунитета слизистой оболочки в трансляционно подходящей модели иммунизации матери.

Интраназальная иммунизация и сбор молока в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...

Исследования материнской иммунизации и переноса антител бесценны по многим причинам, поскольку это начальный путь передачи иммунитета и последующей защиты от патогенов и болезней у новорожденных и младенцев. Благодаря сходству плацентации и переноса антител с человеком, кролики являются отличной моделью материнской иммунизации. В этой видеостатье мы демонстрируем методы, которые наша лаборатория использовала в исследованиях материнской иммунизации у новозеландских белых кроликов, включая интраназальную иммунизацию и сбор молока.Сначала мы опишем пример временной шкалы и серию событий для исследования иммунизации матерей слизистой оболочки у новозеландских белых кроликов. Самки кроликов иммунизируются интраназальным путем, как показано в этом видео. В зависимости от исследования, вакцина может потребовать усиления или может потребоваться введение через дополнительный путь, такой как внутримышечное прививка.Хотя кровь не изображена, она должна быть собрана до первоначальной иммунизации для исходных измерений и в течение остальной части исследования через регулярные промежутки времени. Кровь легко получается центральной артерией уха с помощью мягкой сакации и местного обезболивающего агента. Наличие антиген-специфических уровней IgG может быть измерено в этих образцах.Затем разводят кроликов. Мы предпочитаем приобретать проверенных заводчиков у продавцов для использования, чтобы обеспечить более высокий уровень беременности для этих исследований. В зависимости от сроков иммунизации кролики могут получать дополнительные прививки на протяжении всей беременности.Антиген-специфический IgG переносится трансплацентально в наборы. Примерно через 30-32 дня после размножения беременная будет загощаться. Мы рекомендуем ограничить обработку комплектов в течение первых нескольких дней, чтобы свести к минимуму отказ от нее.Образцы крови могут быть собраны из наборов для оценки антиген-специфических уровней IgG, которые были переданы трансплацентально. Кровь может быть собрана из небольшого количества наборов во время или около времени рождения для оценки ранних уровней антиген-специфических антител. В дополнение к широкому разнообразию питательных веществ, наборы получают антиген-специфический IgA от лактирующих лань во время кормления.Наборы обычно отлучают от отлучения от четырех до восьми недель. Перед отъемом молоко можно легко собрать с лактирующих делает, как показано в этом видео. Затем собранные образцы молока обрабатывают для обнаружения антиген-специфического IgA.В зависимости от исследования, вакцины и буст могут быть введены в наборы, а серийные образцы крови могут быть собраны из наборов в очень раннем возрасте с использованием боковой подкожной вен. Теперь мы продемонстрируем интраназальную иммунизацию и сбор молока в Новозеландском протоколе White Rabbits.Protocol. Все процедуры были одобрены и выполнены в соответствии с политикой Комитета по институциональным уходу и использованию животных Университета Дьюка.Интраназальная иммунизация. Необходимые материалы: ацепромазин, шприц и игла, офтальмологическая смазка, изофлуран, носовой конус, пипетка и наконечники пипетки, вакцина слизистой оболочки. Подготовьте раствор для иммунизации перед обработкой животных.Кроликов утомляют ацепромазином один миллиграмм на килограмм внутримышечно, а обезболивают изофлураном с помощью носового конуса. После полного обезболивания, оцениваемого по рефлексу век, офтальмологическая смазка добавляется к каждому глазу, чтобы предотвратить высыхание глаз и последующее изъязвление роговицы. Как только член лаборатории будет готов ввести вакцину, а кролик окажется в адекватной плоскости анестезии, выключите изофлуран и кислород и удалите носовой конус.Поместите кролика в дорсальную ложную клетку и подпирите шею и голову под углом около 45 градусов, что обеспечивает легкий доступ и визуализацию обоих аларов членом лаборатории, вводимым вакцину. Нагрузите пипетку не более чем 100 микролитрами раствора вакцины и быстро ввести раствор в одну ноздрю и повторить процедуру для второй ноздри. Пипетку следует удерживать под углом примерно 45 градусов.Угол в сторону медиаального аспекта носового прохода. Цель иммунизации заключается в том, чтобы раствор контактирул со слизистой оболочкой наресов. Таким образом, наконечник не следует помещать в нары, так как это может привести к истиранию или раздражению тканей слизистой оболочки и потенциально повлиять на иммуногенность назально вводимой вакцины.Вакцина должна быть введена быстро и сделана таким же образом в другой ноздре. После введения в оба носовых прохода кролика поддерживают в дорсальной лежачем состоянии в течение 30 секунд, чтобы свести к минимуму утечку раствора вакцины. Лаборатория обычно вводит не более 100 микролитров на ноздрю за раз.Если необходимо ввести больший объем с максимальным общим объемом 500 микролитров, вакцина может быть введена в 100 микролитрах аликвоты с 30-секундным периодом отдыха между иммунизациями. И дополнительные введения вакцины повторяют с 30 секундами отдыха между каждым введением до тех пор, пока не будет доставлен общий объем вакцины. После иммунизации поместите кролика на вентиляционную клетку для восстановления и внимательно следите за животным, пока оно не сможет поддерживать стернальную отстойность.В некоторых случаях вакцинная композиция может быть не полностью доставлена в носовую полость, и часть вакцинной композиции может оставаться на внешней части нарезов. В этом случае, поскольку неясно точный объем вакцины, которая была должным образом доставлена в носовую полость, не рекомендуется повторное применение дополнительного вакцинного материала, поскольку это добавит неопределенную переменную к эксперименту. Важно использовать технику доставки вакцины, которая обеспечивает полную и последовательную доставку состава вакцины в нары.Сбор молока. Необходимые материалы: ацепромазин, шприцы и иглы, спиртовой тампон, марля, офтальмологическая смазка, изофлуран, носовой конус, окситоцин и флакон для сбора. Кроликов утомляют ацепромазином один миллиграмм на килограмм внутримышечно, а обезболивают изофлураном с помощью носового конуса.После полного обезболивания, оцениваемого по рефлексу век, офтальмологическая смазка наносится на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз и последующее изъязвление роговицы. Очистите кожу над краевой веной уха спиртовой тампоном. Используя один шприц mil и иглу 25 калибра, вводите примерно одну-две международные единицы окситоцина внутривенно через краевую ушную вену, чтобы вызвать выделение молока.Из-за расслабления гладких мышц кролик обычно мочится или испражняется после введения окситоцина. После введения окситоцина нанесите давление на место инъекции кусочком марли, чтобы обеспечить гемостаз. Сохраняя анестезионную маску или носовой конус над носом кролика, подпирайте кролика на задние четверти.В качестве примечания, сбор молока также может быть выполнен с животным в боковом положении, но лаборатория обнаруживает, что сбор легче, когда кролик подпирается на его крестец с помощником, держащим кролика вертикально с маской анестезии. Откройте стерильную трубку, чтобы подготовиться к сбору молока и найти ткань молочной железы и связанные с ней соски. Кролики обычно имеют от четырех до пяти пар молочных желез.Соски, как правило, окружены влажным мехом от недавнего кормления, а ткань молочной железы легко прощупываются, когда она полна молока. Захватите ткань молочной железы, связанную с соском между большим и указательным пальцами, и нанесите мягкое массирование на железистую ткань в направлении соска. Поместите трубку для сбора над сосок, чтобы собрать сцеженное молоко.Иногда может потребоваться несколько минут, чтобы окситоцин был эффективным, и производство молока, по-видимому, варьируется среди молочных желез. Если скипия молока не увенчался успехом, подождите несколько минут или поверните вокруг дополнительной молочной железы. Молоко из всех сосок можно собирать в одну мерзкую.Обычно несколько миллилитров молока можно легко собрать у лактирующих лася. После того, как желаемый объем молока был собран, выключите изофлуран и кислород и удалите носовой конус у кролика, и дайте кролику восстановиться, находясь под тщательным наблюдением, пока животное не сможет поддерживать стернальную лежачку. Репрезентативные результаты.Рисунок первый. Для материнских исследований определение беременности как можно раньше полезно для подтверждения того, что ладь не нуждается в повторном разведении. Варианты обнаружения беременности включают пальпацию, ультразвук, рентгенограммы, увеличение веса и молекулярные методы, такие как измерения факторов роста инсулина и прогестерона.Адекватный уровень прогестерона необходим для поддержания беременности у кроликов. Поэтому в нескольких исследованиях также оценивались уровни прогестерона у беременных кроликов и демонстрировались повышенные уровни по сравнению с небеременными кроликами, особенно во время органогенеза в середине беременности. Как показано на рисунке один, повышенные уровни прогестерона могут быть обнаружены у беременных кроликов по сравнению с небеременными кроликами даже после того, как спаривание баксом было подтверждено для всех.Уровни прогестерона в сыворотке крови измеряли с помощью автоматизированного хемилуминесцентного анализа. Рисунок второй. Антиген-специфический IgG, который был передан трансплацентально во время беременности, может быть измерен в сыворотке наборов Элизой.Кровь может быть собрана из небольшого количества наборов во время или около времени рождения для оценки ранних уровней антиген-специфических антител. Серийный забор крови технически намного проще, так как наборы стареют и увеличиваются в размерах. Как показано на рисунке два, сывороточные уровни антиген-специфического IgG в наборах можно измерить и сравнить с материнскими уровнями.Матери перенесенные уровни IgG выше при рождении и со временем снижаются. Рисунок третий. Кроличье молоко может быть собрано, как показано в этом видео, и обработано для измерения общих и антиген-специфических уровней антител с помощью Elisa.Как показано на этом рисунке, IgA составляет значительную часть общих антител в грудном молоке, которые доступны для пассивного переноса в наборы. Уровни IgA и IgG значительно выше, чем IgM.Summary. В данной видеостатье описано и демпрородемонстрировал введение интраназальных вакцин и сбор молока у лактирующих кроликов в качестве средства оценки иммунитета слизистой оболочки в трансляционно подходящей модели иммунизации матери.Изображено краткое изображение типичного дизайна исследования интраназальной иммунизации матери, включающего иммунизацию, разведение, расщепление, лактацию и перенос антител.