Überwachung von Protein-Liganden-Interaktionen in menschlichen Zellen durch quantitative In-Zell-NMR in Echtzeit mit einem Bioreaktor mit hoher Zelldichte

In-Cell-NMR ist ein einzigartiger Ansatz, um die strukturellen und dynamischen Eigenschaften biologischer Makromoleküle bei atomarer Auflösung direkt in lebenden Zellen zu beobachten. Proteinfaltung, chemische Modifikationen und Konformationsänderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, können beobachtet werden. Daher hat diese Methode ein großes Potenzial im Rahmen der Arzneimittelentwicklung. Die kurze Lebensdauer menschlicher Zellen, die im NMR-Spektrometer eingeschlossen sind, schränkt jedoch den Anwendungsbereich der In-Cell-NMR ein. Um dieses Problem zu lösen, werden NMR-Bioreaktoren eingesetzt, die die Stabilität der Zellproben im Laufe der Zeit erheblich verbessern und vor allem die Echtzeitaufzeichnung von NMR-Spektren in der Zelle ermöglichen können. Auf diese Weise kann die Entwicklung von Prozessen wie Ligandenpenetration und Bindung an das intrazelluläre Proteintarget in Echtzeit überwacht werden. Bioreaktoren sind oft durch eine geringe Zelllebensfähigkeit bei hohen Zellzahlen begrenzt, was zu einem Kompromiss zwischen der Gesamtempfindlichkeit des Experiments und der Zelllebensfähigkeit führt. Wir haben kürzlich über einen NMR-Bioreaktor berichtet, der eine hohe Anzahl menschlicher Zellen über einen längeren Zeitraum von bis zu 72 h metabolisch aktiv hält. Dieses Setup wurde angewendet, um Protein-Ligand-Wechselwirkungen und die chemische Modifikation von Proteinen zu überwachen. Wir haben auch einen Workflow für die quantitative Analyse der Echtzeit-NMR-Daten eingeführt, der auf der multivariaten Kurvenauflösung basiert. Die Methode liefert Konzentrationsprofile der in den Zellen vorhandenen chemischen Spezies in Abhängigkeit von der Zeit, die weiter analysiert werden können, um relevante kinetische Parameter zu erhalten. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung des NMR-Bioreaktor-Aufbaus und seiner Anwendung zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen in menschlichen Zellen.