Övervakning av protein-ligandinteraktioner i mänskliga celler med kvantitativ NMR i realtid med hjälp av en bioreaktor med hög celldensitet

NMR i celler är ett unikt tillvägagångssätt för att observera de strukturella och dynamiska egenskaperna hos biologiska makromolekyler vid atomupplösning direkt i levande celler. Proteinveckning, kemiska modifieringar och konformationsförändringar inducerade av ligandbindning kan observeras. Därför har denna metod stor potential i samband med läkemedelsutveckling. Den korta livslängden för mänskliga celler som är begränsade i NMR-spektrometern begränsar emellertid tillämpningsområdet för NMR i cellerna. För att lösa detta problem används NMR-bioreaktorer som avsevärt kan förbättra cellprovets stabilitet över tid och, viktigare, möjliggöra realtidsregistrering av NMR-spektra i cellen. På detta sätt kan utvecklingen av processer som ligandpenetration och bindning till det intracellulära proteinmålet övervakas i realtid. Bioreaktorer begränsas ofta av låg cellviabilitet vid höga cellantal, vilket resulterar i en avvägning mellan experimentets totala känslighet och cellviabilitet. Vi rapporterade nyligen en NMR-bioreaktor som upprätthåller ett stort antal mänskliga celler metaboliskt aktiva under längre perioder, upp till 72 timmar. Denna inställning tillämpades för att övervaka protein-ligandinteraktioner och proteinkemisk modifiering. Vi introducerade också ett arbetsflöde för kvantitativ analys av NMR-data i realtid, baserat på multivariat kurvupplösning. Metoden ger koncentrationsprofiler av de kemiska arter som finns i cellerna som en funktion av tiden, som kan analyseras ytterligare för att erhålla relevanta kinetiska parametrar. Här ger vi en detaljerad beskrivning av NMR-bioreaktorns inställning och dess tillämpning för övervakning av protein-ligandinteraktioner i mänskliga celler.