CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

免疫系の機能ゲノミクス研究は、標的遺伝子の欠失と目的のタンパク質への要素の追加の両方を含む遺伝子操作を必要とする。細胞系モデルにおける遺伝子機能の同定は、細胞固有のメカニズムの遺伝子発見と探索に重要である。しかし、特に静止状態では、これらの細胞のトランスフェクション効率が低いため、CRISPR/Cas9を介したノックインを用いたT細胞やマクロファージ細胞株などの免疫細胞の遺伝子操作は困難である。免疫細胞の遺伝子を改変するために、薬物耐性選択およびウイルスベクターは、通常、CRIPSR/Cas9系を発現する細胞を濃縮するために使用され、必然的に細胞の望ましくない介入をもたらす。以前の研究では、エレクトロポレーション後に一時的に発現したCRISPR/Cas9に結合した二重蛍光レポーターを設計しました。この技術的なソリューションは、免疫細胞の迅速な遺伝子欠失につながります;しかし、薬剤耐性選択やウイルスベクターを使用しないT細胞やマクロファージなどの免疫細胞における遺伝子ノックインはさらに困難です。本稿では、細胞選別を用いて、ドナープラスミドと組み合わせて Rosa26 遺伝子座を標的とするCRISPR/Cas9構築物を一時的に発現する細胞の選択を支援することで、薬剤耐性濃縮のないT細胞とマクロファージの両方で遺伝子ノックインを達成できることを示す。一例として、現在のCovid-19大流行を担うSARS-Cov-2の受容体であるヒトACE2を、ノックイン実験を行ってRAW264.7マクロファージで発現させる方法を示す。このような遺伝子ノックイン細胞は、幅広く、機械研究に使用することができる。