Gene Knock-in fra CRISPR/Cas9 og cellesortering i makrofag og T-cellelinjer

Funksjonelle genomikkstudier av immunsystemet krever genetiske manipulasjoner som innebærer både sletting av målgener og tilsetning av elementer til proteiner av interesse. Identifisering av genfunksjoner i cellelinjemodeller er viktig for genoppdagelse og utforskning av celleintrinsiske mekanismer. Imidlertid er genetiske manipulasjoner av immunceller som T-celler og makrofagcellelinjer ved hjelp av CRISPR / Cas9-mediert knock-in vanskelig på grunn av den lave transfeksjonseffektiviteten til disse cellene, spesielt i en passiv tilstand. For å modifisere gener i immunceller, brukes valg av legemiddelresistens og virale vektorer vanligvis til å berike celler som uttrykker CRIPSR / Cas9-systemet, noe som uunngåelig resulterer i uønsket inngrep av cellene. I en tidligere studie designet vi to fluorescerende reportere koblet til CRISPR/Cas9 som ble midlertidig uttrykt etter elektroporasjon. Denne tekniske løsningen fører til rask gensletting i immunceller; Imidlertid er gen-knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uten bruk av valg av legemiddelresistens eller virale vektorer enda mer utfordrende. I denne artikkelen viser vi at ved å bruke cellesortering for å hjelpe til med å velge celler som transient uttrykker CRISPR/Cas9-konstruksjoner rettet mot Rosa26-gresset i kombinasjon med en donorplasmid, kan gen-knock-in oppnås i både T-celler og makrofager uten berikelse av legemiddelresistens. Som et eksempel viser vi hvordan man uttrykker menneskelig ACE2, en reseptor av SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nåværende Covid-19-pandemien, i RAW264.7 makrofager ved å utføre knock-in-eksperimenter. Slike gen knock-in celler kan brukes mye til mekanistiske studier.