Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Los estudios de genómica funcional del sistema inmune requieren manipulaciones genéticas que impliquen tanto la eliminación de genes diana como la adición de elementos a proteínas de interés. La identificación de las funciones génicas en modelos de líneas celulares es importante para el descubrimiento de genes y la exploración de los mecanismos intrínsecos de las células. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de células inmunes como las células T y las líneas celulares de macrófagos utilizando knock-in mediado por CRISPR / Cas9 son difíciles debido a la baja eficiencia de transfección de estas células, especialmente en un estado de reposo. Para modificar los genes en las células inmunes, la selección de resistencia a los medicamentos y los vectores virales se utilizan típicamente para enriquecer a las células que expresan el sistema CRIPSR / Cas9, lo que inevitablemente resulta en una intervención indeseable de las células. En un estudio anterior, diseñamos reporteros fluorescentes duales acoplados a CRISPR / Cas9 que se expresaron transitoriamente después de la electroporación. Esta solución técnica conduce a la rápida deleción de genes en las células inmunes; sin embargo, la eliminación de genes en células inmunes como las células T y los macrófagos sin el uso de la selección de resistencia a los medicamentos o vectores virales es aún más desafiante. En este artículo, mostramos que mediante el uso de la clasificación celular para ayudar a la selección de células que expresan transitoriamente construcciones CRISPR / Cas9 dirigidas al locus Rosa26 en combinación con un plásmido donante, se puede lograr un knock-in de genes tanto en células T como en macrófagos sin enriquecimiento de resistencia a los medicamentos. Como ejemplo, mostramos cómo expresar ACE2 humano, un receptor del SARS-Cov-2, que es responsable de la actual pandemia de Covid-19, en macrófagos RAW264.7 mediante la realización de experimentos en cadena. Tales células de knock-in de genes pueden ser ampliamente utilizadas para estudios mecanicistas.