Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

I dag er kryo-elektrontomografi (cryo-ET) den eneste teknikken som kan gi næratomiske oppløsningsstrukturdata på makromolekylære komplekser in situ. På grunn av den sterke samspillet mellom en elektron med saken, er høyoppløselige cryo-ET-studier begrenset til prøver med en tykkelse på mindre enn 200 nm, noe som begrenser anvendbarheten av kryo-ET bare til de perifere områdene i en celle. En kompleks arbeidsflyt som består av utarbeidelse av tynne cellulære tverrsnitt ved kryofokusert ionstrålemikromaskinering (cryo-FIBM) ble introdusert i løpet av det siste tiåret for å muliggjøre innsamling av kryo-ET-data fra det indre av større celler. Vi presenterer en protokoll for fremstilling av cellulær lamell fra en prøve vitrified ved å stupe frysing ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som et prototypisk eksempel på en eukaryotisk celle med bred utnyttelse i cellulær og molekylærbiologisk forskning. Vi beskriver protokoller for vitrifisering av S. cerevisiae i isolerte flekker av noen få celler eller en kontinuerlig monolayer av cellene på et TEM-rutenett og gir en protokoll for lamellforberedelse ved kryo-FIB for disse to prøvene.