Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

Hoy en día, la crio-tomografía electrónica (crio-ET) es la única técnica que puede proporcionar datos estructurales de resolución casi atómica sobre complejos macromoleculares in situ. Debido a la fuerte interacción de un electrón con la materia, los estudios crio-ET de alta resolución se limitan a especímenes con un grosor de menos de 200 nm, lo que restringe la aplicabilidad del crio-ET solo a las regiones periféricas de una célula. Durante la última década se introdujo un flujo de trabajo complejo que comprende la preparación de secciones transversales celulares delgadas mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado (crio-FIBM) para permitir la adquisición de datos crio-ET del interior de células más grandes. Presentamos un protocolo para la preparación de láminas celulares a partir de una muestra vitrificada por congelación por inmersión utilizando Saccharomyces cerevisiae como ejemplo prototípico de una célula eucariota con amplia utilización en investigación de biología celular y molecular. Describimos protocolos para la vitrificación de S. cerevisiae en parches aislados de unas pocas células o una monocapa continua de las células en una rejilla TEM y proporcionamos un protocolo para la preparación de láminas por crio-FIB para estas dos muestras.