이 연구는 부분적으로 Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS)에 의해 지원되었습니다. 우리는 Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo 및 Skylar Widman이 예비 분석 및 코드 테스트 중 일부를 도운 것을 인정합니다. 토론과 제안에 대해 Mark Slabodnick에게 감사드립니다. WFM은 NIH 그랜트 R35 GM130327의 지원을 인정합니다.

주: 대략 백 개의 S. 코에룰루스 세포의 집단을 이전에 공개된 JoVE 프로토콜8에 따라 배양하였다.
1. 시료 준비
<ol><li>250 μm 두께의 실리콘 스페이서 시트 (재료 표)의 조각을 현미경 슬라이드보다 높이와 너비 모두에서 약간 작게 자릅니다. 5/16" 구멍 펀치를 사용하여 원형 웰을 만듭니다. 좋은 밀봉을 보장하기 위해 이웃 우물 사이에 충분?...

<ol>
	<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Tartar, V., Kerkut, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium.">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li><li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus.">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus.">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).</li><li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell,+Stentor+coeruleus.">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788 (2017).</li><li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration.">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li></ol>

많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시...

스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 4,5,6에 완전히 흘려집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 - 여덟 가지 형태 학적 단계3에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구5에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.
스텐터 재생의 기계론적 분석에는 화학 또는 분자 스크린의 일부로 여러 샘플에 적용할 수 있을 만큼 견고하고 간단한 재생 타이밍을 측정하기 위한 도구가 필요합니다. 세포 기반 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 영상화이며, 이 경우, 재생 동안 새로운 OA의 형성을 이미징한다. 그러나, 이러한 영상-기반 분석은 재생성 구조가 마커로 사용될 수 있는 별개의 분자 성분을 함유할 때 가장 효과적이어서, 이들이 형광 이미지에서 쉽게 검출될 수 있도록 한다. 스텐터 OA의 경우에, 공지된 성분들(섬모, 기저체)은 또한 세포 표면의 나머지 부분에 존재한다; 따라서, OA의 복원을 인식하는 것은 단순히 구성요소의 존재 또는 부재를 찾는 것만으로는 달성될 수 없다.
오히려, OA를 검출하기 위해서는 어떤 형태의 형상 인식이 필요할 것이며, 스텐 터 세포가 종종 빠른 수축 과정을 통해 형태를 변화시킨다는 사실을 감안할 때 이것은 잠재적으로 매우 도전적입니다. 이 논문은 신체 및 OA 섬모의 운동성 활성에 의존하는 재생을위한 대체 분석을 제시합니다. OA가 재생됨에 따라, 새로 형성된 섬모는 위치와 활성의 재현 가능한 변화를 겪으며, 이는 차례로 세포의 수영 운동성에 영향을 미칩니다. 운동성을 분석함으로써, 재생된 구조물의 기능을 정량화함으로써 재생을 정량화하는 "기능적 재생"에 대한 분석을 수행할 수 있다. 재생 중 스텐터 섬모 함수의 이전 분석은 재생7의 여러 단계에서 흐름 패턴의 변화를 관찰하기 위해 외부 매체에 추가 된 트레이서 비드와 결합 된 입자 이미지 속도 측정을 사용했습니다. 그러나이 접근법은 개별 세포 및 관련 유동 필드를 한 번에 하나씩 힘들게 이미징해야합니다.
세포 자체의 움직임을 섬모 생성 흐름의 프록시로 사용함으로써, 고처리량 스크리닝 플랫폼과 호환되는 저해상도 이미징 시스템을 사용하여 더 많은 수의 세포를 병렬로 분석할 수 있을 것이다. 이 분석은 원칙적으로 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 다른 수영 생물에서 발달 및 기능적 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 1은 멀티웰 샘플 슬라이드의 구축을 설명하며, 이는 최대 하루 종일 세포 집단의 높은 처리량 이미징을 허용합니다. 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 조정하는 방법에 대한 세부사항이 제공된다. 프로토콜의 섹션 2는 디지털 단일 렌즈 반사 카메라를 사용하여 해부 현미경에서 수행 할 수있는이 분석을위한 비디오 데이터의 수집을 다룹니다. 프로토콜의 섹션 3에서는 MATLAB 코드(추가 정보)를 사용한 셀 추적 및 셀 속도 계산에 대한 연습을 제공합니다. 프로토콜의 섹션 4에서는 결과를 쉽게 해석할 수 있도록 그림 1C-F 및 그림 2C와 같이 수치 결과를 플롯으로 변환하는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25 mm-thick silicone sheet</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CWS-S-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1034527</td>
			<td>As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Nikon D750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas 137c WT strain</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td>CC-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Image Processing Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox</td>
			<td>MATHWORKS</td>
			<td></td>
			<td>needed for TrackCells.m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope with camera port</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized Spring Water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1379801</td>
			<td>Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of motility patterns of stentor during and after oral apparatus regeneration using cell tracking

스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.

이 분석의 목표는 큰 (N ~ 100) 재생 스텐터 집단 내에서 세포로부터의 이동 패턴의 점진적 변화와 이동 속도의 단계적 증가를 정량화하는 것입니다. 결과 해석을 돕기 위해 이 프로토콜에 포함된 사용자 지정 코드는 비디오 데이터 집합의 모든 셀 이동 추적의 오버레이(그림 1C-F 및 그림 S1)와 재생성 시작 이후 시간별 수영 속도 플롯의 두 가지 유형의 플...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking at JoVE.com

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

스텐터 코에룰루스는 오랫동안 단세포 재생을 이해하기 위한 모델 유기체로 사용되어 왔다. 시각적 형태학적 재생을 위한 타임라인은 알려져 있지만, 기능적 재생을 위한 타임라인은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 분석은 손실 기능의 회복이 정량화될 수 있도록 동기화된 재생을 겪는 중심 집단의 운동성을 추적한다.다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 적응될 수 있다. 이미징 챔버의 안전한 씰이 없으면 웰이 서로 누출되거나 웰 내부에 기포가 형성됩니다. 실리콘 스페이서의 사용에 익숙하지 않은 연구자의 경우 PSW 또는 기타 깨끗한 매체를 각 웰에 피펫팅하여 사용 전에 누출을 테스트하는 것이 좋습니다.샘플 챔버의 구성은 구두로 묘사 된 것보다 쉽게 표시됩니다. 획득한 비디오 데이터로부터 운동성 패턴을 추출하는 과정도 마찬가지이다. 시작하려면 현미경 슬라이드보다 높이와 너비가 약간 작은 250 마이크로 미터 두께의 실리콘 스페이서 시트 조각을 자릅니다.전체 펀치를 사용하여 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 둔 원형 웰을 만들어 좋은 씰을 확보하십시오. 2 분 동안 10 % sucrose 또는 2 % uria에서 스텐터 coeruleus 세포를 배양하여 구강 장치의 재생을 시작하십시오. 그런 다음 신선한 매체로 세 번 씻으십시오.각 웰에 약 10 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 부피와 가능한 한 가깝게 일치시키도록주의하십시오. 한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각을 부드럽게 내려 웰을 닫으십시오.10 마이크로 리터 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 좋은 밀봉을 보장합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 현미경을 사용 가능한 가장 낮은 배율로 설정하여 프레임에 잘 맞도록 합니다. 시간 경과를 시작하고 각 시점에서 각 웰의 초당 30 프레임으로 10 초 비디오를 획득하십시오.보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다. 두 스크립트를 다운로드하고, 셀을 추적하고, 추적하고, 추적한 흔적을 컴퓨터에서 기억하기 쉬운 위치로 이동하고, 데이터 비디오를 이 컴퓨터로 전송합니다.데이터 비디오를 폴더로 구성합니다. 각 시점마다 하나씩. 스크립트 트랙 셀을 사용하여 트랙 셀을 열고 스크립트 경로 추가를 실행하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다."팝업 창이 나타나면 일반적으로 지정된 폴더에서 스크립트를 처음 실행할 때만 발생합니다.메시지가 표시되면 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하여 추적을 시작합니다. 데이터 비디오로 이동하여 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오."변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부하려면 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 깨끗한 추적을 엽니 다. 프롬프트에서 트랙 셀별로 출력 된 데이터 폴더를 선택하십시오.생성 된 폴더 중 하나로 이동하여 선택하십시오. 메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 하나를 입력하고 추적을 거부하려면 0을 입력합니다. 그런 다음 Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다.스파게티 플롯이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 파일 브라우저 창이 프롬프트와 함께 나타나면 열 폴더를 선택합니다.시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 메시지가 표시되면 보정, 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까? 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.기본적으로 RR이 네 개로 설정된 스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다. 최대 네 밀리미터의 반경을 포함합니다. 플롯을 저장합니다.결과는 구강 장치 재생 과정으로 두 시간, 세 시간, 일곱 시간 및 여덟 시간에 스텐터 세포 집단의 집단적 운동성을 보여줍니다. 이 플롯은 운동성 개체의 수의 예상 증가와 집단 내에서 가장 운동성 세포의 범위에서 네 배 증가를 모두 보여줍니다. 가장 빠른 수영 셀은 가장자리 가까이에서 시작하면 직선으로 완전히 수영하는 것이 제한되며 이동 범위가 작아 보입니다.관 세포는 세 가지 별개의 범주로 분류되었는데, 눈에 보이는 홀드가 빠르지 않은 비운동성, 가시적 인 보류가 빠른 비운동성, 그리고 모타일로 분류되었다. 결과는 이러한 범주에 걸친 상대적 셀 수를 재생성에 대한 함수로 요약하는 누적 히스토그램을 보여주었습니다. 나중에, 상당한 수의 세포가 눈에 보이는 보류 금식을 가진 식민지에서 발견되었는데, 이는 그들이 환경을 탐험하고 그들의 종류의 다른 사람들 근처에 우선적으로 붙어 있음을 강하게 암시합니다.크기가 약 한 밀리미터 인 스텐터 코에룰루스에 대해 잘 작동하는 샘플 우물 치수를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에는 직경 5/16 인치의 실리콘 스페이서 두께와 웰 당 10 개의 셀이 포함됩니다. 이 숫자는 다른 세포 유형에 대해이 프로토콜을 적용 할 때 조정되어야합니다.이 분석은 상이한 스텐터 표현형의 재생을 조사하고 비교하기 위해 RNA-I와 함께 수행될 수 있다.