نعترف بدعم التمويل من مركز جنوب غرب المحيط الهادئ الإقليمي للتميز للأمراض المنقولة بالنواقل الممول من المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (الاتفاقية التعاونية 1U01CK000516)، منحة CDC NU50CK000420-04-04، المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأميركية (مشروع هاتش 1025565)، وزمالة مختبر الحشرات الطبية في فلوريدا UF/IFAS إلى Tse-Yu Chen، ومنحة المرحلة الثانية من المرحلة الثانية من اتفاقية الأمن القومي CAMTech CAMTech (AWD05009_MOD0030)، ووزارة الصحة في فلوريدا (CONTRACT CODQJ). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المقالة هي تلك التي المؤلف (ق) ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر دائرة الأسماك والحياة البرية في الولايات المتحدة.

1. تخزين العينات العامة والاستعدادات قبل استخراج الحمض النووي
<ol><li>هيدرات العينة في 100 ميكرولتر من الماء PCR الصف لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجة مئوية إذا تم تخزين العينة في الكحول >70٪ لتنعيم الأنسجة.</li>
</ol>2. تعطيل العينة
<ol><li>تعيين حاضنة أو اهتزاز كتلة الحرارة في 56 درج?...

<ol>
	<li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes.">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314 (2015).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California.">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes.">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events.">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473 (2019).</li><li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets.">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li><li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector,+Anopheles+arabiensis.">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).</li><li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects.">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211 (2016).</li><li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification.">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li><li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S&#227;o+Tom&#233;+island.">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from S&#227;o Tom&#233; island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li><li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+(Howardina)+busckii+and+Aedes+(Ochlerotatus)+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba.">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li><li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis.">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li></ol>

يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لأنواع الحشرات الأخرى. وقد تم اختبار النسخة الأصلية من البروتوكول الذي تم تقديمه في نيمان وآخرون1 على أنواع متعددة، بما في ذلك Aedes aegypti، Ae. busckii، Ae. taeniorhynchus، Anopheles arabiensis، An. coluzzii، An. coustani, An. دارلينجي, An. funestus, An. غامبي, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, C...

وقد سمح التطور الأخير لبروتوكول استخراج الحمض النووي المحسن1 بالعديد من الدراسات عالية التأثير في المصب التي تنطوي على تسلسل الجينوم الكامل2و3و4و5و6. يوفر بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي هذا غلة الحمض النووي الموثوقة من عينات البعوض الفردية ، مما يقلل بدوره من التكلفة والوقت المرتبط بالحصول على عدد كاف من العينات من مجموعات الحقول.
وترتبط التطورات الأخيرة في علم الجينوم السكاني والمناظر الطبيعية ارتباطا مباشرا بانخفاض تكاليف تسلسل الجينوم بأكمله. على الرغم من أن بروتوكول استخراج الحمض النووي السابق1 يزيد من الكفاءة المرتبطة بالتسلسل الإنتاجي العالي ، إلا أن المختبرات / الدراسات الأصغر بدون الأموال قد تختار عدم استخدام هذه المناظر الطبيعية القوية الجديدة وأدوات الجينوم السكاني بسبب تكاليف تنفيذ البروتوكول (على سبيل المثال ، تكاليف الأدوات المتخصصة).
هنا، يتم تقديم بروتوكول استخراج الحمض النووي المعدلة التي تستخدم خطوة استخراج حبة مغناطيسية مماثلة نيمان وآخرون1 للحصول على الحمض النووي عالية النقاء ولكن لا تعتمد على أدوات عالية التكلفة لتحلل الأنسجة واستخراج الحمض النووي. هذا البروتوكول مناسب للتجارب التي تتطلب >10 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AE Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19077</td>
			<td>Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AL Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19075</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW1 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19081</td>
			<td>Washing buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AW2 Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19072</td>
			<td>Washing buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract Suspension G</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026901</td>
			<td>magnetic bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator</td>
			<td>Epigentek</td>
			<td>Q10002-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>microvolume spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4489111</td>
			<td>Proteinase K buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>fluorometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a magnetic-bead-based mosquito dna extraction protocol for next-generation sequencing

اقترح بروتوكول استخراج الحمض النووي الذي نشر مؤخرا باستخدام الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الآلي أنه من الممكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية من بعوضة فردية محفوظة جيدا كافية لتسلسل الجينوم الكامل في المصب. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على أداة استخراج الحمض النووي الآلية باهظة الثمن مانعة بالنسبة للعديد من المختبرات. هنا ، توفر الدراسة بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على حبة مغناطيسية صديقة للميزانية ، وهو مناسب للنسب المنخفضة إلى المتوسطة. تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا بنجاح باستخدام عينات البعوض Aedes aegypti الفردية. سيؤدي انخفاض التكاليف المرتبطة باستخراج الحمض النووي عالي الجودة إلى زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.

وكان متوسط غلة الحمض النووي لكل رأس البعوض الفردية / أنسجة الصدر 4.121 نانوغرام / ميكرولتر (N = 92، الانحراف المعياري 3.513) تقاس باستخدام مقياس الفلورومتر عند التملبد باستخدام 100 ميكروغرام من العازلة elution. وهذا يكفي ل10-30 نانوغرام متطلبات إدخال الحمض النووي الجينوم اللازمة لبناء مكتبة الجينوم كله<...

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

الموصوف هنا هو بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي لإنتاج استخراج الحمض النووي عالية الجودة من البعوض. هذه الاستخراجات مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي من المصب.

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

هذا البروتوكول الاستخراج الحمض النووي الصديقة للميزانية المغناطيسية القائمة على حبة يجعل تسلسل الإنتاجية العالية في متناول مختبرات الموارد المحدودة والدراسات. لا يتطلب هذا البروتوكول معدات باهظة الثمن لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة ويمكن أن يكون مفيدا في بعض الحالات التشخيصية أو البحثية حيث يكون الحصول على كمية كافية من الحمض النووي بجودة عالية لتسلسل الإنتاجية أمرا صعبا. هذا البروتوكول سهل النسخ المتماثل مع عرض توضيحي لمرة واحدة.يجب أن يتم تجربتها مع عدد صغير من العينات أولا للتعرف على سير العمل. للبدء، هيدرات عينات أنسجة البعوض المخزنة في الكحول أكثر من 70٪عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المياه الصف PCR واحتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية لتنعيم الأنسجة. بعد الحضانة، تجاهل الماء وإضافة 100 ميكرولتر من بروتيناز K مزيج الانزيم العازلة.ثم استخدم أنبوب الطرد الدقيق pestle لتجانس الأنسجة. بعد التجانس، والطرد المركزي الأنسجة lysate واحتضان لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في 56 درجة مئوية. لاستخراج الحمض النووي، ماصة 100 ميكرولتر من الأنسجة lysate في أنبوب جديد الطرد الدقيق نظيفة.ثم أضف 215 ميكرولتر من مزيج حبة مغناطيسية رئيسية. باستخدام ماصة، اخلطي خليط اليزيت والخرز المغناطيسي لمدة 10 إلى 20 ثانية، ثم اتركيه يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، هز الأنبوب برفق أحيانا لزيادة ربط الحمض النووي بالخرز المغناطيسي.بعد ذلك ، ضع الأنبوب على فاصل الخرز المغناطيسي حتى يصبح الحل واضحا. ثم باستخدام ماصة، يستنشق السائل بلطف من الأنبوب دون إزعاج الخرز المغناطيسي عقد الحمض النووي. نقل أنبوب بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وغسل الخرز بإضافة 325 ميكرولتر من العازلة غسل واحد.تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على فاصل الخرز المغناطيسي وأزل النافورة كما هو موضح سابقا ، ثم حرك الأنبوب بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي واغسل الخرز مرة واحدة مع غسل العازلة. بعد غسل الثاني مع العازلة واحدة، وغسل الخرز مرتين مع 250 ميكرولتر من العازلة الغسيل اثنين بنفس الطريقة.بعد الغسيل الأخير، حرك الأنبوب بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي وأضف 100 ميكرولتر من العازلة elution. تخلط جيدا عن طريق pipetting ثم احتضان الأنبوب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة قبل وضعه مرة أخرى على فاصل المغناطيسي. عندما يصبح الحل واضحا، قم بنقل المسخ الفائق إلى أنبوب طرد دقيق جديد ونظيف 0.5 ملليلتر وتخزينه بشكل مناسب.يظهر هنا كقراءة نموذجية لمقياس الفلورومتر الدقيق للحمض النووي للبعوض في مخزن مؤقت elution يحتوي على 0.5 ملليمولار EDTA. متوسط 260 إلى 280 نانومتر نسبة الامتصاص هو 2.3. يوضح هذا الجدول التكاليف وعدد العينات التي تمت معالجتها في يوم عمل واحد لطرق استخراج مختلفة.الكواشف النموذجية والتكلفة الاستهلاكية لاستخراج بواسطة هذا البروتوكول حوالي 9.50 لكل عينة. هذه التكلفة تعادل أي طريقة استخراج نموذجية قائمة على حبة مغناطيسية. تأتي الفائدة الرئيسية من تكلفة هذا البروتوكول من عدم الحاجة إلى أداة استخراج الحمض النووي الآلية.تأكد من تغيير نصائح ماصة بين العينات لمنع التلوث المتبادل للحمض النووي عند العمل مع عينات متعددة. نحن نستخدم الحمض النووي عالي الجودة المستخرج باستخدام هذه الطريقة لتسلسل الجينوم بأكمله. ونحن نستخدم حاليا بيانات التسلسل لتحديد الطفرات الجديدة في مقاومة المبيدات الحشرية أو الجينات المناعية التي تثير القلق في مجال الصحة العامة ومكافحة الأمراض.إن وجود حلول بأسعار معقولة لتسلسل الإنتاجية العالية يفتح أبوابا مثيرة لعلم الجينوم السكاني وعلم الجينوم الطبيعي الذي يهدف إلى فهم تشتت البعوض وتدفق الجينات مما يؤثر على نجاح العديد من استراتيجيات التحكم الجيني الجديدة.