Abstract
Biochemistry
Makromolekylær krystallografi med lang bølgelængde (MX) udnytter de uregelmæssige spredningsegenskaber af elementer, såsom svovl, fosfor, kalium, chlor eller calcium, der ofte er til stede i makromolekyler. Dette muliggør direkte strukturopløsning af proteiner og nukleinsyrer via eksperimentel fasning uden behov for yderligere mærkning. For at eliminere den betydelige luftabsorption af røntgenstråler i dette bølgelængderegime udføres disse eksperimenter i et vakuummiljø. Beamline I23 hos Diamond Light Source, UK, er det første synkrotroninstrument af sin art, designet og optimeret til MX-eksperimenter i det lange bølgelængdeområde mod 5 Å.
For at gøre dette muligt omslutter en stor vakuumbeholder alle slutstationskomponenter i prøvemiljøet. Nødvendigheden af at opbevare prøver ved kryogene temperaturer under opbevaring og dataindsamling i vakuum kræver anvendelse af termisk ledende prøveholdere. Dette letter effektiv varmefjernelse for at sikre prøvekøling til ca. 50 K. Den nuværende protokol beskriver de procedurer, der anvendes til prøveforberedelse og overførsel af prøver til vakuum på beamline I23. For at sikre ensartethed i praksis og metoder, der allerede er etableret inden for det makromolekylære krystallografisamfund, kan prøvekøling til flydende nitrogentemperatur udføres i enhver laboratorieindstilling udstyret med standard MX-værktøjer.
Kryogen opbevaring og transport af prøver kræver kun standard kommercielt tilgængeligt udstyr. Der kræves specialudstyr til overførsel af kryogent afkølede krystaller fra flydende nitrogen til vakuumendestationen. Skræddersyede prøvehåndteringsværktøjer og et dedikeret kryogent overførselssystem (CTS) er blevet udviklet internt. Diffraktionsdata indsamlet på prøver udarbejdet ved hjælp af denne protokol viser fremragende fusionsstatistikker, hvilket indikerer, at kvaliteten af prøverne er uændret under proceduren. Dette åbner unikke muligheder for in-vacuum MX i et bølgelængdeområde ud over standard synkrotronstrålelinjer.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved