Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。