Vi takker alle patienter og deres familier for at deltage i undersøgelsen. Vi takker det kliniske team, der faciliterede vores forskning. Vi er taknemmelige for støtten fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) starttilskud 850571 (J.D.), Det Nederlandske Kræftsamfund (KWF)/Alpe d'HuZes Bas Mulder Award (nr. 10218, J.D.), Oncode Institute og Foundation Children Cancer Free (KiKa nr. 292, C.C.)

BEMÆRK: De eksperimenter, der er beskrevet heri, blev godkendt af den medicinske etiske komité under Erasmus Medical Center (Rotterdam, Holland) og Princess Máxima Center for Pediatric Oncology (Utrecht, Holland).
1. Generering af menneskelige nyre tubuloider fra væv
<ol><li>Materialer<ol>
<li>Præwarm multiwell væv kultur plader (6, 12 og 24 brønde) natten over ved 37 °C.</li>
		<li>Forbered basal medium (AdDF+++) ved at tilsætte 1x L-alanin/L-glutamintilskud, 1% w/v 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansyre (HEPES, 10 mM) og 1% Penicillin/Streptomycin antibiotika til Advanced DMEM/F12.</li>
		<li>Forbered kulturmedium ved at tilføje 1,5% B27 supplement, 10% R-spondin-konditioneret medium, epidermal vækstfaktor (50 ng/mL), fibroblast vækstfaktor-10 (100 ng/mL), N-acetylcystein (1,25 mM), Rho-kinase hæmmer Y-27632 (10 μM), bredspektret antibiotika (0,1 mg/ml) og A83-01 (5 μM) til AdDF+++. Varm til 37 °C før brug.</li>
		<li>Kældermembranekstraktet (BME) forberedes ved at optø en aliquot natten over ved 4 °C. Hold BME på is under proceduren.</li>
		<li>Tilbered kollagenopløsning ved fortynding af kollagenase til en endelig koncentration på 1 mg/mL i AdDF+++ med tilsætning af 10 μM Y-27632. Varm op til 37 °C.</li>
		<li>Forbered 10 cm Petri retter, skalpeller, og pincet. Desinficer redskaberne ved at påføre en ultraviolet lampe i 20 min, efterfulgt af vask med desinfektionsmiddel, demivand og 70% v/v ethanol. Lufttørrer redskaberne.</li>
		<li>Forvarm en vandret shaker til 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedure<ol>
<li>Saml nyrevæv i et 50 mL rør fyldt med 30-40 mL AdDF +++ medium. Placer stykket af væv i ~ 1 mL medium i en 10 cm Petri fad. Hakke væv i stykker af ~ 1 mm3 størrelse ved hjælp af skalpeleller (Figur 1A).</li>
		<li>Overfør hakket væv til et 15 ML rør ved hjælp af sammenkæd og skalpeller. Tilføj 5 mL AdDF +++ til Petriskålen, vask og saml mediet med en 10 mL steril pipette. Overfør alt dette indhold til det samme rør.</li>
		<li>Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved stuetemperatur, og fjern supernatanten. Tilsæt 3-4 mL kollagenopløsning til 15 mL-røret. Flyt røret til en vandret shaker indstillet til 37 °C og en hastighed på 250 omdrejninger.</li>
		<li>Efter de første 15 minutters inkubation kontrolleres prøven og røret rystes kraftigt. Gentag indtil suspensionen er homogen, og de fleste stykker væv er forsvundet, med en maksimal inkubationstid på 45-60 min. (Figur 1B).</li>
		<li>Fyld røret op med AdDF+++, og bland ved at invertere røret 5-10x. Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Hvis pellet er rød, skal du fortsætte med trin 1.2.6. Ellers skal du gå til trin 1.2.8.</li>
		<li>Der tilsættes 1 mL af den røde blodlegemers lysisbuffer (se materialetabellen) oven på cellepillen. Tryk forsigtigt på røret for at genbruge pelleten (må ikke genbruges med pipettespids). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.</li>
		<li>Fyld røret op med AdDF+++. Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Hvis blodcellerne stadig er synlige, gentages proceduren igen, startende fra trin 1.2.6. Ellers skal du fortsætte med trin 1.2.8.</li>
		<li>Hvis vævsstykker er synlige på dette tidspunkt i protokollen, skal du fortsætte med trin 1.2.8. Ellers fortsættes med målingen af pelletvolumen i trin 1.2.9. Tilsæt 5 mL AdDF+++ til røret, og genbrug med en 10 mL steril pipette. Filtrer affjedringen gennem en 100 μm nyloncelles si placeret på et 50 mL rør.</li>
		<li>Overfør den filtrerede affjedring til et nyt 15 ML rør. Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Mål lydstyrken på cellepillen ved hjælp af en p1000-pipette, der er indstillet til en kendt diskenhed. Rør forsigtigt op og ned for at genbruge uden at skabe luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.</li>
		<li>Tilsæt 70-75% volumen af BME til pellet. Resuspend ved hjælp af en p1000 eller p200 pipette og plade 15 μL dråber i en forvarm, multiwell celle kultur plade (6, 12 eller 24 brønde, baseret på den samlede plating volumen (<100 μL, 24 brønde; 100-200 μL, 12 brønde; >200 μL, 6 brønde)).</li>
		<li>Vend pladen på hovedet, og lad pladen hvile i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C (Figur 1C). Tilføj præwarmed kulturmedium, og inspicere kulturer (Figur 1C,D).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Generering af menneskelige nyre tubuloider fra urin
BEMÆRK: Urin er et fjendtligt miljø for celler. Det er vigtigt for en vellykket udførelse af denne protokol, at urinprøver behandles så hurtigt som muligt, helst inden for 4 timer fra udskillelse. I mellemtiden skal urinprøver opbevares ved 4 °C.
<ol><li>Materialer<ol>
<li>Præwarm multiwell væv kultur plader (6, 12 og 24 brønde) natten over ved 37 °C.</li>
		<li>Klargør vaskemedium: AdDF+++ suppleret med bredspektret antibiotika (0,1 mg/mL) og 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Forbered kulturmedium som beskrevet ovenfor. Varm op ved 37 °C før brug.</li>
		<li>Forbered BME matrix. Hold på is under proceduren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedure<ol>
<li>Saml en urinprøve, og del den ligeligt op i 50 mL-rør (Figur 2A-I). Tilsæt 10-20 mL vaskemedium til hvert af rørene. Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C (Figur 2A-II), og fjern supernatanten forsigtigt.</li>
		<li>Tilsæt 10 mL vaskemedium til hvert af rørene. Genbrug forsigtigt pellets ved hjælp af en 10 mL steril pipette. Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C (Figur 2A-III), og fjern supernatanten forsigtigt.</li>
		<li>Resuspend pellets, og overføre indholdet af alle rørene i en 15 mL rør. Fyld røret med vaskemedium. Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C (Figur 2A-IV), og fjern supernatanten.</li>
		<li>Mål lydstyrken på cellepillen ved hjælp af en p1000-pipette, der er indstillet til en kendt diskenhed. Rør forsigtigt op og ned for at genbruge uden at skabe luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.</li>
		<li>Tilsæt 70-75% volumen af BME til pellet. Resuspend ved hjælp af en p1000 eller p200 pipette og plade 15 μL dråber i en forvarm, multiwell celle kultur plade (6, 12 eller 24 brønde, baseret på den samlede plating volumen (<100 μL, 24 brønde; 100-200 μL, 12 brønde; >200 μL, 6 brønde)).</li>
		<li>Vend pladerne på hovedet i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C. Tilføj præwarmed kultur medium, og inspicere kulturer (Figur 2B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Udvidelse af tubuloid kulturer
BEMÆRK: Tubuloid kulturer kan passages ca hver 1-2 uger med et split ratio på 1:2-1:3. De kan typisk udvides til ca. 15 passager med linjespecifikke variationer.
<ol><li>Materialer<ol>
<li>Præwarm multiwell væv kultur plader (6, 12 og 24 brønde) natten over ved 37 °C.</li>
		<li>Forbered basal medium (AdDF+++), og opbevar det på is under proceduren.</li>
		<li>Forbered kulturmedium som tidligere beskrevet. Varm op til 37 °C før brug.</li>
		<li>Forbered BME matrix, og holde på is under proceduren.</li>
		<li>Prøveudskiftningsmidlet forberedes med tilsætning af Y-27632 til en koncentration på 10 μM. Varm op til 37 °C før brug.</li>
		<li>Autoklave ikke-filtreret p10 tips.</li>
		<li>Centrifugen afkøles til 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedure<ol>
<li>Forstyrre dråberne, der indeholder tubuloider ved pipetter op og ned med en p1000 pipette ved hjælp af mediet til stede i brønden. Brug spidsen til at skrabe bunden af brønden, og sørg for at samle alle celler fastgjort til bunden.</li>
		<li>Saml indholdet i et 15 ML rør. Tilføj 10 mL AdDF+++. Centrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten.</li>
		<li>Baseret på pelletens størrelse tilsættes trypsinerstatningsmiddel suppleret med 10 μM Y-27632. Brug 1 mL trypsinerstatningsmiddel til 200 μL BME-dråber, der indeholder tubuloider. Inkuberes ved 37 °C i 5 min.</li>
		<li>Brug en p1000 pipette med spids, og indsæt en ikke-filtreret, steril p10-spids over 1000 μL-spidsen. Pipette op og ned i 20-30x for mekanisk at forstyrre organoiderne.</li>
		<li>Kontroller under mikroskopet for at se, om der stadig findes mange intakte organoider i røret (Figur 3A). Hvis mere end 10% af intakte organoider er til stede på dette tidspunkt, gentages fra inkubationen på 5 min i trin 3.2.3 til den mikroskopiske observation for intakte organoider i trin 3.2.5 igen. Ellers skal du fortsætte med trin 3.2.6.</li>
		<li>Fyld røret op med AdDF+++. Centrifuge ved 300 × g i 5 min ved 4 °C, og fjern supernatanten. Mål lydstyrken på cellepillen ved hjælp af en p1000-pipette, der er indstillet til en kendt diskenhed. Rør forsigtigt op og ned for at genbruge uden at skabe luftbobler. Overfør røret til is i 1 min.</li>
		<li>Tilsæt 70-75% volumen af BME til pellet. Resuspend ved hjælp af en p1000 eller p200 pipette og plade 15 μL dråber i en forvarm, multiwell celle kultur plade (6, 12 eller 24 brønde, baseret på den samlede plating volumen (<100 μL, 24 brønde; 100-200 μL, 12 brønde; >200 μL, 6 brønde)).</li>
		<li>Vend pladerne på hovedet, og lad pladen hvile i inkubatoren i 15-20 min ved 37 °C. Tilføj præwarmed kultur medium, og inspicere kulturer (Figur 3B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Romagnani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+kidney+disease.">Chronic kidney disease.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 3, 17088 (2017).</li><li>Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+childhood+kidney+tumours.">Organoid models of childhood kidney tumours.</a> Nature Reviews. Urology. 17 (6), 311-313 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Low, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+PSC-derived+kidney+organoids+with+patterned+nephron+segments+and+a+de+novo+vascular+network.">Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 373-387 (2019).</li><li>Little, M. H., Combes, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids:+accurate+models+or+fortunate+accidents.">Kidney organoids: accurate models or fortunate accidents.</a> Genes &amp; Development. 33 (19-20), 1319-1345 (2019).</li><li>Papapetrou, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+in+cancer+research+and+precision+oncology.">Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Schutgens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubuloids+derived+from+human+adult+kidney+and+urine+for+personalized+disease+modeling.">Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).</li><li>Jun, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+organotypic+culture+model+of+human+kidney.">Tubular organotypic culture model of human kidney.</a> PLoS One. 13 (10), 0206447 (2018).</li><li>Grassi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+a+new+model+for+improving+regenerative+medicine+and+cancer+personalized+therapy+in+renal+diseases.">Organoids as a new model for improving regenerative medicine and cancer personalized therapy in renal diseases.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 1-15 (2019).</li><li>Yousef Yengej, F. A., Jansen, J., Rookmaaker, M. B., Verhaar, M. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+and+tubuloids.">Kidney organoids and tubuloids.</a> Cells. 9 (6), 1326 (2020).</li><li>Calandrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+biobank+for+childhood+kidney+cancers+that+captures+disease+and+tissue+heterogeneity.">An organoid biobank for childhood kidney cancers that captures disease and tissue heterogeneity.</a> Nature Communications. 11 (1), 1310 (2020).</li><li>Jansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+and+functional+comparison+of+proximal+tubule+cell+lines+established+from+human+urine+and+kidney+tissue.">A morphological and functional comparison of proximal tubule cell lines established from human urine and kidney tissue.</a> Experimental Cell Research. 323 (1), 87-99 (2014).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples.">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nature Protocols. 7 (12), 2080 (2012).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer.">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Morales-Alvarez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrotoxicity+of+antimicrobials+and+antibiotics.">Nephrotoxicity of antimicrobials and antibiotics.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (1), 31-37 (2020).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo.">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li><li>D&#246;rrenhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+exfoliated+epithelial+cells+from+different+locations+of+the+human+urinary+tract+and+the+renal+tubular+system.">Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system.</a> Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Organoider betragtes som avatarer af det væv, hvorfra de er afledt. De giver mulighed for hurtig udvidelse af patientmateriale, samtidig med at de genotypice og fænotypiske egenskaber ved oprindelsesvævet15bevares . Organoid teknologi har for nylig åbnet dørene for udvikling af mere repræsentative prækliniske modeller, som kan bruges som vigtige værktøjer til at oversætte resultater fra bænken til sengen. Nyre tubuloider er lovende in vitro modeller til test af narkotika-induceret nefrotoksicitet, en almindelig bivirkning af mange kemoterapi medicin2,8,12. Som sådan, patient-afledt tumor organoid kulturer blev påvist at være prædiktiv for patientens reaktion på behandling16,17,18. Test af lægemidler på en high-throughput måde på tubuloider derfor potentielt giver mulighed for bedre definition af terapeutiske vinduer og mindsker risikoen for lægemiddel-induceret nefrotoksicitet hos patienter.
Almindeligt anvendte antibiotika er blevet beskrevet for at udøve en toksisk effekt på nyrerne19. Selv om tilstedeværelsen af bredspektret antibiotika er nødvendig for en vellykket etablering af kulturerne ved at forhindre forurening, er det vigtigt at overveje deres potentielle nefrotoksicitet. Selv om der ikke er observeret negative virkninger af antibiotika på etableringen af tubuloidkulturer, er der behov for yderligere undersøgelser for at evaluere deres virkninger grundigt. Tubuloider kan udnyttes til at studere og modellere sygdomme8. Ciliopatier (patologisk dysfunktion af cilier) samt andre genetiske syndromer, der påvirker nyrerne, kan studeres ved enten at generere tubuloidlinjer direkte fra berørte forsøgspersoner eller ved at bruge sunde kulturer, hvor sygdomsspecifikke drivermutationer kan introduceres via CRISPR /Cas9-genomredigering20.
Selvom tubuloider er flercellede nyrekulturer, mangler de flere nyrecelletyper, herunder podocytter og endotelceller8. Desuden, i modsætning til nogle andre ASC-afledte organoid modeller, tubuloider har et begrænset replikativt potentiale, da de kan dyrkes for ca 15 passager. Denne begrænsede levetid kan dog forlænges betydeligt ved tilsætning af Wnt til kulturmediet21. Yderligere optimering af tubuloid kultur protokol er nødvendig for at gøre dem endnu mere repræsentative for nyrerne, herunder mere differentierede celletyper. Selv om effektiviteten af tubuloid etablering fra vævsprøver er meget høj (>95%), kan det i sjældne tilfælde mislykkes. Der kan være forskellige årsager, herunder: 1) dårlig kvalitet af udgangsmaterialet (f.eks.nekrotisk væv som følge af lægemiddelbehandling), 2) overdtagelse af vævsprøven eller 3) forurening af den primære prøve.
For at sikre, at kvaliteten af de modtagne vævsprøver er tilstrækkelig til at fortsætte med protokollen, er det vigtigt at opretholde tæt kontakt med patologipersonalet, der udfører evalueringen af vævet ved operationen. Hvis der foreligger tilstrækkeligt materiale, skal dets levedygtighed bekræftes ved histologisk undersøgelse(f.eks.hæmatoxylin og eosinfarvning). For at forhindre celle lysis under enzymatisk fordøjelse er det desuden vigtigt, at inkubationsproceduren ikke er længere end 1 time. Endelig bør der for at forhindre forurening tilsættes antibiotika og svampedræbende midler til vaske- og kulturmedierne.
Urin kan indeholde eksfolierede epitelceller, der ikke er afledt afnyrerne 22, som kan forurene tubuloidkulturerne. Disse omfatter for eksempel urotelceller, der i modsætning til nyredekniske celler er positive for tumorprotein P63 og negative for PAX88. Det anbefales derfor at teste kulturerne for PAX8-positivitet for at bekræfte renheden af etablerede nyre tubuloidlinjer, før man fortsætter med opfølgende forsøg (Figur 4B).
Urin repræsenterer et fjendtligt miljø for celler på grund af højt osmotisk tryk og lav pH. Det er derfor afgørende for protokollens succes, at prøverne behandles så hurtigt som muligt ved urinindsamling. Som sådan bør den indsamlede urin fortyndes og vaskes grundigt med bufferopløsning så hurtigt som muligt for at sikre tilstedeværelsen af levedygtige celler på tidspunktet for såning. Succesraten for tubuloid etablering vil falde betydeligt, hvis urinen opbevares i flere timer før forarbejdning. Endelig, selvom steril, urin har en høj risiko for forurening forbundet med indsamlingsprocessen. Det er derfor vigtigt at supplere vaske- og vækstmedium med antibiotika og svampedræbende midler. Når man tager højde for alt det ovenstående, kan der opnås en succesrate på ca. 50%.

Nyrer udføre funktionen af systemisk at kontrollere balancen af kropsvæsker. Svækkelsen af deres fysiologiske funktion kan være forårsaget af forskellige faktorer, herunder diabetes, forhøjet blodtryk og lægemiddelinducerettoksicitet 1. For en bedre forståelse af normal nyrefysiologi samt udvikling af nyresygdomme er brugen af repræsentative prækliniske modeller afgørende. I de senere år er der genereret flere in vitro nyremodeller baseret på den såkaldte organoidteknologi2. Organoider er tredimensionelle, flercellede strukturer, der ligner morfologien og fysiologien i vævet (normalt eller sygt), hvorfra de stammer. De kan genereres fra pluripotente (PSC'er) eller voksne stamceller (ASCs), hver med deres egne egenskaber og applikationer.
PSC-afledte nyreorganoider efterligner nefrosogenese3,4,5. De kan også etableres fra patient-afledte engagerede celler ved tvungen dedifferentiation (induceret pluripotency eller iPSC). iPSC'er kan efterfølgende differentieres i de forskellige celletyper af nephron, den funktionelle enhed af nyrerne, ved rettidig eksponering for specifikke vækstfaktor cocktails. Mens skabe en temmelig komplet mini-organ i en skål, deres etablering forbliver tidskrævende, og på grund af omprogrammering protokol, iPSCs kan være modtagelige for uønsket genetisk ustabilitet6. Desuden er iPSC-organoider ikke i stand til fuldt ud at modnes til voksne nyreceller, hvilket afslører en transskriptomprofil, der ligner fosterets nyre på et tidligt udviklingsstadium7.
ASC-afledte menneskelige nyre tubuloider har vist sig at rekapitulere fornyelsen af voksne nyre epitel. De repræsenterer primært den proksimale tubule, loop af Henle, distale tubules og opsamlingskanal, som bekræftet af udtrykket af forskellige transportproteiner8,9,10. Tubuloid kultur protokol giver mulighed for hurtig udvidelse af patient-afledt nyrevæv, samtidig med at et stabilt genom. Forskningsapplikationer omfatter undersøgelse af normal nyrefysiologi, nefrotoksicitet, lægemiddeltest samt sygdomsmodellering8,10,11,12. En potentiel begrænsning af etableringen af patient-afledte organoid kulturer, herunder tubuloider, er tilgængeligheden af frisk væv. Men flere rapporter har vist, at urin kan tjene som en kilde til nyre epitelceller, hvilket giver en meget enklere, mindre invasiv strategi for at opnå patientmateriale til tubuloid kulturer8,13,14. Faktisk har det for nylig vist sig, at tubuloider kan dyrkes fra urin8. Denne artikel beskriver etablering og vedligeholdelse af tubuloid kulturer fra nyrevæv og urin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td>Stock of 5 mM, final concentration of 5 &#181;M, activin receptor-like kinase 5 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antiPAX8 antibody</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>LS-B13466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock of 50x, final concentration of&#160; 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;C9407</td>
			<td>Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock of 100x, final concentration of 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td>Stock of 1 M, final concentration of 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 12 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 24 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 6 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Stock of 10.000 U/mL, final concentration of&#160; 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin - broad-range antibiotics</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells lysis buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RhoKinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td>Stock of 100 mM, final concentration of 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe Express/ trypsin replacement agent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human kidney tubuloids from tissue and urine

Voksne stamcelle (ASC)-afledte menneskelige nyre epitelorganoider, eller tubuloider, kan etableres fra sunde og syge nyre epitel med høj effektivitet. Normale nyre tubuloider rekapitulere mange aspekter af deres væv af oprindelse. De repræsenterer forskellige nephron segmenter - især af den proksimale tubule, loop af Henle, distale tubules, og indsamling kanal - og kan bruges til at studere normal nyre fysiologi. Desuden letter tubuloidteknologi sygdomsmodellering, f.eks.for infektionssygdomme såvel som for kræft. Opnåelse af nyre epitelceller til tubuloid generation er imidlertid afhængig af rester kirurgisk materiale (såsom delvise) nefrectomies) eller nål biopsier. Evnen til at dyrke tubuloider fra urin ville give en alternativ, mindre invasiv kilde til sunde nyre epitelceller. Det har tidligere vist sig, at tubuloid kulturer med succes kan genereres fra kun et par milliliter frisk indsamlet urin. Denne artikel beskriver protokollerne til at generere og udbrede ASC-afledte menneskelige nyre tubuloid kulturer fra væv og urinprøver.

For nyrevæv forekommer tubuloidstrukturer typisk inden for 7 dage efter etablering (figur 1D). Manglende tilsyneladende vækst inden for de første 7 dage indikerer et mislykket resultat af protokollen. Generelt skal tubuloidkulturer passeres inden for 1-2 uger efter første plating. For urin bliver cellevæksten tydelig ca. 14-21 dage efter etablering med udseende af kompakte tubuloidstrukturer og/eller klæbende celler i bunden af pladen (Figur 2B). Kultur etablering sandsynligvis har slået fejl, hvis ingen vækst kan påvises med en brightfield mikroskop inden for 4 uger efter plating. For urin-afledte kulturer, den første passaging generelt forekommer mellem 3 og 4 uger. Mens nyre tubuloidkulturer i de første passager hovedsageligt består af kompakte strukturer, øges tilstedeværelsen af cystiske epitel tubuloider med stigningen i passagenummeret (Figur 1D og figur 2B). Den vellykkede generation af menneskelige nyre tubuloid kulturer kan vurderes ved at udføre immunohistokemisk farvning for markører udtrykt i rørformet nyre epitel, såsom parret boks gen 8 protein (PAX8) (Figur 4A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig01.jpg"> Figur 1: Vævsafledte nyre tubuloidkulturer. (A) Oversigt over proceduren for hakkekød nyrevæv. Væv er hakket til en størrelse på ~ 1 mm3 ved hjælp af skalpeller. (B) Eksempel på korrekt enzymatisk fordøjelse af sundt nyrevæv. Væv er vist før (venstre) og efter (højre) 45 min enzymatisk fordøjelse med kollagenase. Få stykker væv er stadig synlige i bunden af røret, og opløsningen skal blive overskyet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af celler i suspensionen. (C) Repræsentativt billede af cellekulturplader efter plating af BME-dråber, der indeholder det forarbejdede nyrevæv. Efter plating af dråberne vendes kulturpladerne på hovedet (venstre) og placeres i inkubatoren ved 37 °C. Efter 15-20 min tilsættes præwarmed kulturmedium til brønden (højre). (D) Repræsentative lysbilleder af vævsbaserede tubuloidkulturer. De første tubuloid strukturer bliver synlige 2-3 dage efter første såning. Med stigende passage numre, tubuloids typisk ændre morfologi til en mere cystisk fænotype. Skalastænger = 300 μm. Forkortelser: BME = kældermembranekstrakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig02.jpg"> Figur 2: Urin-afledte nyre tubuloid kulturer. (A) Oversigt over urinprøve behandling. Så hurtigt som muligt efter indsamling(I) urinprøver er opdelt i 50 mL rør og fortyndet i vaskemed (II). Efter et andet vasketrin (III) samles indholdet af rørene, og der udføres et tredje og sidste vasketrin (IV) før plating. (B) Repræsentative lysbilleder af urinbaserede tubuloidkulturer. De første tubuloidstrukturer og klæbende celler skal være synlige inden for 21 dage efter første plating. Skalastænger = 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig03.jpg"> Figur 3: Passaging af nyre tubuloid kulturer. (A) Repræsentativt billede af nyre tubuloid kulturer efter enzymatisk fordøjelse. Efter at have afsluttet fordøjelsen, bør ikke mere end 10% af intakte tubuloid strukturer forblive. Vægtstang = 300μm. (B) Repræsentativt billede af nyre tubuloidkulturer efter plating. Inspektion af kulturer bekræfter, at størstedelen af tubuloiderne er blevet forstyrret. Skalalinje = 300 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig04.jpg"> Figur 4: Histologisk karakterisering af tubuloidkulturer. (A) H&E farvning af sundt nyrevæv og tubuloider. Skalabarer = 100 μm. (B) Immunohistochemistry af PAX8 i normalt nyrevæv, tubuloider, MRTK-væv og MRTK-organoider. PAX8 positivitet af organoid strukturer bekræfter deres nyre epitel oprindelse. Sundt nyrevæv viser både positive (tubules) og negative strukturer (glomeruli). MRTK-væv og organoider blev inkluderet som negativ kontrol. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; PAX8 = parret boks gen 8; MRTK = ondartet rhabdoid tumor i nyrerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine at JoVE.com

Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Menneskelige nyre tubuloid kulturer repræsenterer en værdifuld in vitro model til at studere nyrefysiologi og sygdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevæv (sund og syg) samt urin, sidstnævnte repræsenterer en let opnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.

Generation af humane nyre tubuloider fra væv og urin

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Nyre tubuloid kulturer kan etableres fra sundt nyrevæv og fra urin giver mulighed for generering af repræsentative modeller til at studere nyresygdom og fysiologi. Denne protokol giver mulighed for generering af sunde nyre tubuloider fra væv og urin, sidstnævnte er en ikke-invasiv og patient-venlige måde at opnå materiale til generation af kulturer. Tubuloid kulturer kan bruges til at studere nyrefysiologi og til sygdom modellering, såsom smitsomme, ondartede, og arvelige nyresygdomme.For at generere menneskelige nyre tubuloider fra væv, placere nyrevæv prøve i en milliliter af avancerede DMEM plus plus medium i en 10 centimeter Petri parabol og bruge skalpeller til at hakke vævet i stykker af en cirka en kubik millimeter størrelse. Brug knold og skalpel til at overføre vævsstykkerne til et 15 milliliterrør og vask fadet med fem milliliter frisk medium. Brug en steril 10 milliliter pipette til at overføre mediet til røret.Sediment vævsstykkerne ved centrifugering og resuspend pellet i tre til fire milliliter kollagenopløsning. Inkuber vævene på en vandret shaker ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i 45 til 60 minutter med kraftig rysten hvert 15. minut. Når suspensionen er homogen, og de fleste vævsstykker er fordøjet, fyldes røret med medium og blandes fem til 10 gange ved inversion.Centrifugere suspensionen. Hvis pellet er rød, tilsættes en milliliter røde blodlegemer lysis buffer til røret for en fem-minutters inkubation ved stuetemperatur. I slutningen af inkubationen vaskes røret med frisk medium.Hvis vævsstykker stadig er synlige, skal du genbruge pelleten med fem milliliter frisk medium og filtrere suspensionen gennem en 100 mikron cellesnak i et 50 milliliterrør. Overfør den filtrerede suspension til et nyt 15 milliliterrør til centrifugering, og brug en P1000-pipette indstillet til et kendt volumen til at måle mængden af cellepillen. Genbrug forsigtigt pellet uden at skabe luftbobler og inkubere cellerne i et minut på is.I slutningen af inkubationen, genbruge pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber af den resulterende suspension i en 37 grader opvarmet multi-brønd celle kultur plade. Når alle dråberne er blevet belagt, inkuberes pladen på hovedet ved 37 grader Celsius i 15 til 20 minutter, tilsæt derefter det passende volumen på 37 grader Celsius opvarmet kulturmedium og inspicere kulturerne under et lysfeltmikroskop. For at generere menneskelige nyre tubuloider fra urin, opdele urinprøven ligeligt mellem 50 milliliter rør og vaske prøverne to gange med 10 til 20 milliliter frisk vask medium pr vask.Efter den anden vask, genbruge pellets i deres resterende supernatants og pool prøverne i en enkelt 15 milliliter rør for en tredje centrifugering. Mål cellepillevolumenet som demonstreret, og genbrug forsigtigt pelleten uden at skabe luftbobler. Efter et minut inkubation i is, genbruge pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber af den resulterende suspension i 37 grader Celsius opvarmet multi-brønd celle kultur plader som påvist, derefter inkubere dråberne på hovedet i 15 til 20 minutter, før du tilføjer frisk medium og se kulturer ved lys mikroskopi.Efter en til to uger af hver type kultur, skal du bruge en P1000 pipette til at forstyrre tubuloid dråber i hver brønd ved hjælp af spidsen til at skrabe bunden af brøndene til at indsamle de vedhæftede celler. Træk brønden indholdet i en enkelt 15 milliliter rør, der indeholder 10 milliliter af avancerede DMEM plus plus medium og indsamle tubuloider ved centrifugering. Baseret på pelletens størrelse tilsættes trypsinerstatningsmiddel suppleret med 10 mikromolar Y27632 for en fem minutters inkubation ved 37 grader Celsius.I slutningen af inkubationen skal du bruge en 1.000 mikroliter pipettespids med en 10 mikroliter pipettespids placeret over spidsen for at pipette tubuloidaffjedringen 20 til 30 gange. Kontroller under mikroskopet for at se, om der stadig er intakte tubuloider i røret. Det mindre end 10% af intakte tubuloider er til stede, fylde røret med frisk avanceret DMEM plus plus plus, og indsamle tubuloider ved centrifugering at tillade pellet volumen, der skal måles som påvist.Resuspend pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber i en 37 grader Celsius opvarmet multi-godt celle kultur plade. Efter en 15 til 20-minutters omvendt inkubation ved 37 grader Celsius, tilsæt forvarmet kulturmedium til dråberne og inspicere kulturen ved let mikroskopi. Tubuloider genereret fra nyrevævsprøver vises typisk inden for syv dage efter kulturinstitutionen og skal passages inden for en til to uger efter plating.I urinkulturer vises kompakte tubuloidstrukturer og klæbende celler ca. 14 til 21 dage efter plating, og første passaging forekommer generelt mellem tre og fire uger. Tilstedeværelsen af cystiske epitel tubuloider stiger med hver passage. Den vellykkede generation af menneskelige nyre tubuloid kulturer kan vurderes ved immunohistokemisk farvning for markører udtrykt i rørformede nyre epitel, såsom parret boks gen 8 protein.En korrekt timing af enzymatisk fordøjelse af vævsmateriale og hurtig behandling af urinprøver er afgørende skridt for det vellykkede resultat af disse protokoller. Den høje effektivitet af etablering af nyre tubuloid kulturer kan bane vejen for patient-specifikke test af narkotika-induceret nefrotoksicitet, en almindelig bivirkning af mange kemoterapier.