我们要感谢西奈山伊坎医学院病理学和神经外科的成员，感谢他们帮助采购去识别化的脑组织，并感谢ISMMS的流式细胞术CORE专家建议。该研究的部分资金来自NIH RF1DA048810，R01NS106229，R03NS101581（到N.M.T.）和R61DA048207（到S.A.）。

注意：西奈山伊坎医学院（ISMMS）的人类受试者保护计划及其机构审查委员会（IRB）确保研究的道德行为并遵守联邦，州和机构法规。在这项研究中，所有使用的死后标本都经过去鉴定，通过生物储存库在适当的同意下获得，并且被ISMMS的IRB（HS#14-01007）免除了“人类研究”的称号。
1. 缓冲液制备
注意：如果进行下游RNA测序，请使用RNase...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).</li><li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PsychENCODE+project.">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).</li><li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy.">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse.">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions.">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li><li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

在考虑了几个生物学和技术因素后，应最终确定按照概述的方案进行的实验设计。起始组织样品是新鲜冷冻的，无需固定，并且优选具有较短的死后收集间隔，以最大限度地提高细胞核回收率。根据经验，长达24小时的PMI可以充分恢复细胞核;然而，PMI为12小时或更短时间可优选以优化完整细胞核的恢复。除PMI外的其他因素，包括身体储存温度和组织pH值，也可能影响细胞核产量，但这些研究没有考...

人类星形胶质细胞的分子复杂性在原代组织中仍然定义不清，需要更好的工具在健康和疾病中以高分辨率分离和表征它们。由于新鲜脑组织样本的获取有限，神经胶质和神经元过程的紧密相互联系的性质以及加工过程中不可避免的细胞活化，完整的人类神经元和神经胶质细胞从其生态位中分离已被证明是困难的，所有这些都限制了这些细胞类型的 离体1的分子表征。.荧光激活的细胞核分选（FANS）已成为活细胞分选的替代方案，能够从冷冻组织中解离和免疫标记细胞群。在过去的十年中，FANS已被广泛用于分离和分子表征各种脑标本和解剖区域中的人类神经元（NeuN +）细胞核群体1，2，3，4。
然而，从人体皮层中分离特定神经胶质核亚群的类似方法受到限制，导致在理解正常和患病组织中的星形胶质细胞复杂性方面相对缺乏复杂性。为此，先前发表的方案适用于使用FANS 4分离人类神经元群体，并且验证了一种使用三抗体组合富集星形胶质细胞（和少突胶质体祖细胞）的方法，在静息和反应条件下捕获星形胶质细胞5。为了特异性富集NeuN-级分中的星形胶质细胞，使用抗体对抗已知在星形胶质细胞群体中差异表达的两种转录因子之一，PAX6或SRY-box转录因子9（SOX9）6，7。PAX6在萌发区的桡骨神经胶质细胞样祖细胞内的早期胎儿发育过程中高度表达，并有助于神经发生和胶质生成8，9，10，11 以及视网膜神经元规格12。在成人中，PAX6在静息人星形胶质细胞6 中差异性过表达，并在人癫痫组织星形胶质细胞13中显示蛋白质与神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共表达。
该协议描述了通过FANS同时分离新皮质神经元和富含星形胶质细胞的细胞核群体。首先从成人皮层收集的新鲜（未固定）速冻（即新鲜冷冻）死后组织以机械和化学方式解离。在蔗糖梯度中裂解和超速离心后，丢弃细胞质和细胞外成分，同时保留细胞核。然后用对应于所需靶谱系的荧光偶联核抗体标记细胞核，并使用FANS进行分类。遵循这种方法，在收集的PAX6 + NeuN-群体中证明了星形胶质细胞的富集，并通过靶向qPCR小组以及下游核RNA测序进行验证。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

人类星形胶质细胞的复杂性在初级人体组织中仍然定义不清，需要更好的工具来分离和分子表征。荧光激活的细胞核分选（FANS）可用于从冷冻的档案组织中成功分离和研究人类神经元核（NeuN+）群体，从而避免与处理新鲜组织相关的问题。然而，缺乏从非神经元（NeuN-）元件中分离出类似星体的努力。最近开发和验证的免疫标记策略使用三种转录因子抗体同时从非患病、新鲜（未固定）速冻的死后人类颞叶新皮层组织中分离富集神经元（NeuN+）、星形胶质细胞（成对盒蛋白6 （PAX6）+NeuN-）和少突胶质细胞祖细胞 （OLIG2+NeuN-）细胞群。
该技术被证明可用于表征原发性病理性癫痫新皮层中细胞类型特异性转录组改变。转录组学分析证实，PAX6 + NeuN-分选的群体在静息和反应条件下都能强健地富集泛星形胶质细胞标志物并捕获星形胶质细胞。本文介绍了从新鲜冷冻的人皮层中分离富含星形胶质细胞的细胞群的FANS方法，包括组织解离成单核（sn）悬浮液;用抗NeuN和抗PAX6荧光偶联抗体对细胞核进行免疫标记;FANS门控策略和质量控制指标，用于优化分选过程中的灵敏度和特异性以及确认星形胶质细胞富集;并建议采购批量或Sn分辨率的下游转录组和染色质可及性测序。该方案适用于具有各种病理的非坏死，新鲜冷冻，人皮质标本，并推荐在24小时内收集死后组织。

从新鲜（未固定）速冻颞新皮层组织中收集细胞核，死后收集时间为12 h。在组织解离成细胞核悬浮液后，将样品与针对NeuN，PAX6和OLIG2的抗体一起孵育，并根据 图1 和 图2所示的门控进行分类。从新核+、PAX6+新核-和寡核2+新核-排序的群体中收集（图1E，F 和 图2F）。靶向qPCR小组显示，PAX6 +（NeuN-?...

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Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

我们开发了一种从新鲜冷冻组织中富集和分离人类星形胶质细胞群的方法，用于下游分子分析。

使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

该协议可以帮助有兴趣研究人类星形胶质细胞在其天然生态位中的分子功能的科学家。该技术的主要优点是，它允许使用荧光活化细胞核分选从大量人脑组织标本中分离和富集特定细胞类型，成体星形胶质细胞。该方法可用于使用其他适当的荧光偶联抗体从人新皮层中分离其他细胞类型，例如神经元和少突胶质细胞祖细胞。开始从新鲜冷冻的人体皮层组织样本中解剖约200至400毫克的组织。将组织置于含有四毫升冰冷裂解缓冲液的七毫升玻璃组织解液中，并将组织研磨约50次。将匀浆转移到12毫升超速离心机聚丙烯管中。使用5毫升移液管将6.5毫升冰冷的蔗糖缓冲液加入超速离心管的底部，而不会干扰蔗糖和组织匀浆之间的界面。为了收集细胞核，将裂解物以101，814倍G超速离心一小时，并小心地吸出上清液和碎屑而不会干扰沉淀。在PBS中加入0.1%BSA到超速离心管中，在冰上孵育10分钟，然后重悬核沉淀。然后，使用台盼蓝在光学显微镜下观察完整的细胞核，并确保浓度高于每毫升10至第五个细胞核对于分离的细胞核的荧光活化分选，将约20微升重悬的样品加入含有Alexa fluor 555偶联小鼠抗NeuN抗体的抗体溶液中。将约20微升重悬的样品加入含有APC偶联小鼠抗PAX6抗体的抗体溶液中。在四摄氏度下振荡孵育一小时后，避光，以1：1000的比例向所有样品和对照添加DAPI。为了包括适当大小的细胞核并排除红细胞和碎片，请使用对照管通过其前向和侧面散射区域来门控细胞。要选择单线态核群，请按前向散射面积与前向散射宽度或高度以及侧向散射面积与侧散射宽度或高度进行门。通过DAPI进行门，仅包括完整的核单线态，并排除任何碎片和双线体。根据任何其他荧光对照进行门控后，运行仅DAPI对照样品。运行仅限 NeuN Alexa 荧光 555 的对照，以确定 Alexa Fluor 555 通道中 NeuN 阳性染色的截止值。运行仅限 PAX6 的 APC 控制，以确定 APC 通道中 PAX6 阳性染色的截止值。运行完所有对照组后，对 NeuN 阳性细胞进行门控以收集神经元，并将 PAX6 阳性细胞与 NeuN 阴性群体进行门控以收集星形胶质细胞。从 NeuN 阴性 PAX6 阴性人群中取出并收集任何额外的感兴趣的神经胶质细胞群。对于大宗单核RNA测序，在0.04%BSA补充的PBS中收集50， 000至500， 000个细胞核后，向样品中加入2毫升蔗糖溶液，50微升一摩尔氯化钙和30微升单摩尔乙酸镁。使用PBS将悬浮液的最终体积增加到10毫升。通过倒置混合管内容物，并将反应物在冰上孵育15分钟。通过离心沉淀细胞核，并将细胞核重悬于一毫升RNA提取试剂中。然后，涡旋管，将样品冷冻在干冰上，并将细胞核储存在零下80摄氏度。对于体单核转座酶可接受的染色质测序，将50， 000至75， 000个细胞核收集到0.04%BSA补充的PBS中，在涂有5%BSA的微量离心管中，并冷冻细胞核直到其下游分析。神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞核细胞群可以从新鲜冷冻的死后人颞新皮层样本中分选，如图所示。单核RNA测序研究进一步优先考虑PAX6作为原生质和纤维状成星胶质细胞亚群中顶级差异表达的核转录因子。分选后，可以表征原发性病理性癫痫新皮层中的细胞类型特异性转录组改变。在该分析中，转录组学分析证实，PAX6阳性NeuN阴性群体在全星形胶质细胞标志物方面被强烈富集，在神经元标志物中耗尽。免疫荧光染色可用于确认 PAX6 与神经胶质纤维酸性蛋白在人皮质星形胶质细胞中的共定位。较短的死后间隔与新鲜组织样本中完整的细胞核恢复率更高有关。高产量的完整细胞核可以在死后24小时内从冷冻组织中恢复，但在30小时时，很少有完整的细胞核可以恢复。要记住的最重要的事情是从NeuN阴性人群中获取PAX6阳性人群，因为有些神经元也表达PAX6，我们希望排除这些神经元。该技术还允许研究癫痫手术脑标本中的星形胶质细胞，进一步阐明了在特定病理生态位背景下人类星形胶质细胞的分子失调。

使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群

Abstract