Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale della proteina (PTM) coinvolta nella regolazione di diverse vie cellulari, tra cui l'elaborazione dell'RNA, la trasduzione del segnale, la risposta al danno del DNA, la biogenesi dei miRNA e la traduzione.

Negli ultimi anni, grazie agli sviluppi biochimici e analitici, la proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS) è emersa come la strategia più efficace per caratterizzare il metil-proteoma cellulare con risoluzione a sito singolo. Tuttavia, l'identificazione e la profilazione della R-metilazione della proteina in vivo da parte della SM rimane impegnativa e soggetta a errori, principalmente a causa della natura substechiometrica di questa modifica e della presenza di varie sostituzioni aminoacidiche e metil-esterificazione chimica di residui acidi che sono isobarici alla metilazione. Pertanto, sono necessari metodi di arricchimento per migliorare l'identificazione di R-metil-peptidi e strategie di convalida ortogonale per ridurre i tassi di falsa scoperta (FDR) negli studi di metil-proteomica.

Qui viene descritto un protocollo specificamente progettato per l'identificazione e la quantificazione di R-metil-peptidi ad alta affidabilità da campioni cellulari, che accoppia la marcatura metabolica delle cellule con la metionina codificata da isotopi pesanti (hmSILAC) e la digestione in soluzione a doppia proteasi dell'estratto di cellule intere, seguita dal frazionamento cromatografico off-line ad alto pH a fase invertita (HpH-RP) e dall'arricchimento di affinità di R-metil-peptidi utilizzando anticorpi anti-pan-R-metile. Dopo l'analisi MS ad alta risoluzione, i dati grezzi vengono prima elaborati con il pacchetto software MaxQuant e i risultati vengono quindi analizzati da hmSEEKER, un software progettato per la ricerca approfondita di coppie di picco MS corrispondenti a peptidi metilici leggeri e pesanti all'interno dei file di output MaxQuant.