Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности

Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.

В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.

Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.