지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

항바이러스 약물 발견은 높은 처리량 스크리닝(HTS) 형식으로 수행될 수 있는 신뢰할 수 있는 생화학 및 세포 분석을 개발해야 합니다. 플라비바이러스 비구조적(NS) 단백질은 폐막 성 망막(ER) 멤브레인상에서 공동 적으로 조립하여 복제 복합체(RC)를 형성하는 것으로 생각된다. NS3와 NS5는 RC의 가장 연구된 효소이며 바이러스 성 게놈 복제에 중요한 역할로 인해 약물 개발을위한 주요 목표를 구성합니다. NS3 프로테아제 도메인은 NS2B를 공동 인자로 요구하며, 미성숙 한 바이러스 성 폴리 단백질을 성숙한 NS 단백질로 절단하는 반면 NS5 RdRp 도메인은 RNA 복제를 담당합니다. 본명, 지카 바이러스(ZIKV) 복제억제제에 대한 대형 화합물 라이브러리를 테스트하기 위해 레플리콘 기반 스크리닝 및 효소 분석에 사용되는 프로토콜을 자세히 설명한다. Replicons는 바이러스 구조 유전자가 기자 유전자로 대체되는 포유류 세포에서 발현된 자기 복제 형유증 시스템입니다. 바이러스 RNA 복제에 대한 화합물의 억제 효과는 리포터 단백질 활성의 감소를 측정하여 쉽게 평가할 수 있다. 레플리콘 기반 검진은 레닐라 루시파라제를 리포터 유전자로 발현하는 BHK-21 ZIKV 레플리콘 세포주를 이용하여 수행하였다. 확인된 화합물의 특정 표적을 특성화하기 위해, 당사는 재조합발현 NS3 프로테아제 및 NS5 RdRp를 위한 체외 형광 계 의 애사를 확립했습니다. 바이러스 성 프로테아제의 프로테오리틱 활성은 불소 펩타이드 기질 Bz-nKRR-AMC를 사용하여 측정되었다. NS5 RdRp 신장 활성은 RNA 신장 동안 SYBR Green I의 형광 신호의 증가에 의해 직접 검출되었지만, 합성 바이오티니드 셀프 프라이밍 템플릿 3′UTR-U30(5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCCUCUAGU-3')을 이용하여.