We danken professor Hans Clevers voor het verzorgen van de cellijnen om recombinant R-spondin1 te produceren. Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het National Key R & D-programma van China (2019YFA0111400), de National Natural Science Foundation of China (31970779) aan H.H., en de Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group van Shandong University (2020QNQT003) aan H.H.

Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de School of Basic Medical Sciences aan de Shandong University en werden uitgevoerd volgens de licentie onder de richtlijnen en voorschriften van het ministerie van Binnenlandse Zaken (nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
OPMERKING: Dit protocol wordt voornamelijk gebruikt om 3D-organoïden te kweken uit geïsoleerde primaire hepatocyten.
1. Oprichting van Murine Hepatocyte Organoid Culture
...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Het vermogen om volwassen hepatocyten gedurende lange perioden te kweken is van fundamenteel belang bij het bestuderen van de basiswetenschap van de lever, medicijntoxicologie en hepatotrope gastheer-microbiologische infecties zoals malaria en de hepatitisvirussen. Met een goed gedefinieerde niche zet het protocol hier een kweeksysteem op voor hepatocyten. Dit protocol drijft volwassen hepatocyten om uit te breiden in 3D-cultuur met een heterogeniteit die cel-celinteractie, de meeste hepatocytenfunctie en genetische modi...

Organoïden zijn zelfgeorganiseerde, driedimensionale (3D) in vitro clusters die zelfvernieuwende stamcellen en multi-lineage gedifferentieerde cellen bevatten1,2. De organoïden van veel organen zijn vastgesteld uit pluripotente of volwassen stamcellen door goed gedefinieerde nichefactoren, waaronder de darm, de hersenen, de dikke darm, de nier, de lever, de alvleesklier, de schildklier, de maag, de huid en de long3,4,5,6,7 . De organoïden recapituleren fysieke celfuncties door ofwel ontwikkeling na te bootsen (afkomstig van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen, PSC's) of homeostase / regeneratieprogressie (afkomstig van volwassen stamcellen, ASC's), wat nieuwe wegen opent in ziekteonderzoek en -therapie8,9.
Als grootste orgaan bij zoogdieren is de lever vooral verantwoordelijk voor opslag, metabolisme en ontgifting. Twee soorten epitheelceltypen, hepatocyten en cholangiocyten, construeren de basiseenheid van een leverlobule. Hepatocyten zijn verantwoordelijk voor 70-80% van de leverfunctie10. Hoewel de lever een opmerkelijk regeneratievermogen heeft, gebeurt snel verlies van hepatocytenkenmerken tijdens traditionele monolaagkweek door ontregelde celpolarisatie en dedifferentiatie, waardoor de behoefte van onderzoekers en clinici om 'gap-bridging' levermodellen in een schaal te bouwen, toeneemt. Tot voor kort waren de ex vivo expansiemodellen van primaire hepatocyten echter niet goed vastgesteld11,12,13,14,15. Leverorganoïden kunnen worden vastgesteld uit embryonale / geïnduceerde pluripotente stamcellen, fibroblastconversie in hepatocytachtige cellen en weefsel-afgeleide cellen. De ontwikkeling van leverorganoïden stimuleert de toepassing van een in vitro model voor geneesmiddelenscreenings en levertoxiciteitstests16,17.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het vaststellen van leverorganoïden uit muriene primaire hepatocyten. Door dit protocol te gebruiken, hebben we een in vitro kweeksysteem van hepatocytenorganoïden opgezet met twee perfusies van collagenase. Deze organoïden kunnen maandenlang worden gepasseerd voor langdurige expansie. Hun fysiologische functie is zeer consistent met hepatocyten. Verder geven we ook een gedetailleerde beschrijving van hoe genetische manipulatie kan worden uitgevoerd, zoals lentivirusinfectie, siRNA-transductie en CRISPR-Cas9-engineering met behulp van organoïden. De verspreiding van hepatocytenorganoïden werpt licht op de mogelijkheid om organoïden te gebruiken om leverbiologie te begrijpen en gepersonaliseerde en translationele medische benaderingen te ontwikkelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

De lever is het grootste orgaan bij zoogdieren. Het speelt een belangrijke rol bij glucoseopslag, eiwitsecretie, metabolisme en ontgifting. Als uitvoerder voor de meeste leverfuncties hebben primaire hepatocyten een beperkte prolifererende capaciteit. Dit vereist de oprichting van ex vivo hepatocytenexpansiemodellen voor leverfysiologisch en pathologisch onderzoek. Hier isoleerden we muriene hepatocyten door twee stappen van collagenaseperfusie en stelden we een 3D-organoïde cultuur vast als de 'mini-lever' om cel-celinteracties en fysieke functies samen te vatten. De organoïden bestaan uit heterogene celpopulaties waaronder voorlopers en volwassen hepatocyten. We introduceren het proces in detail om de muriene hepatocyten of foetale hepatocyten te isoleren en te kweken om organoïden te vormen binnen 2-3 weken en laten zien hoe ze te passeren door mechanisch op en neer te pipetteren. Daarnaast zullen we ook introduceren hoe de organoïden in afzonderlijke cellen kunnen worden verteerd voor lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering. De organoïden kunnen worden gebruikt voor medicijnscreening, ziektemodellering en fundamenteel leveronderzoek door leverbiologie en pathobiologie te modelleren.

De hepatocytenorganoïden van vrouwelijke Alb-Cre; Rosa26-GFP-muizen (8 weken) werden vijf dagen na het zaaien waargenomen (figuur 1A). De organoïden woekeren met Ki67 positieve kleuring (figuur 1B). Interfererende expressie van representatieve genen in hepatocytenorganoïden door siRNA-transfectie of lentivirusinfectie werd onderzocht met qRT-PCR en western blot. De resultaten zijn weergegeven in figuur 2A en 2B. ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

De lever is het grootste orgaan bij zoogdieren. Het speelt een zeer belangrijke rol in het metabolisme en ontgifting. Hoewel de lever in vitro een opmerkelijke regeneratiecapaciteit heeft, is het nog steeds een zeer grote uitdaging voor een lange termijn om hepatocyten in vitro te kweken.Hier stellen we de hepatocyten organoïden vast van volwassen hepatocyten. Het behoudt de belangrijkste kenmerken van hepatocyten in morfologie en functie. In deze video zullen we introduceren hoe we deze organoïden kunnen kweken en passeren en hoe we de genetische modificatie van deze organoïden in detail kunnen uitvoeren.Ten eerste, leverperfusie en spijsvertering. Bereid alle regio's en de instrumenten voor en maak ze steriel. Was de muis en open het epidermale en de huid en probeer vervolgens de buideloven van de lever te vinden.Injecteer de naalden erin en vang dit vervolgens op. Doe de perfusie met een snelheid van vijf milliliter per minuut, totdat de lever bleek wordt. Verander ze in de perfusiebuffer, plaats ze zorgvuldig, let op de lever, totdat deze zacht wordt.Meestal duurt het drie tot vijf minuten, knip dan de lever en doe ze in de platen en knip ze in kleine stukjes met de schaar. Pep het regelmatig op en neer. Meestal duurt het 10 tot 15 minuten om ze in de enkele cel te maken.En pep het dan op en neer met 10 tot 15 minuten en voer ze door de monteur. Maak er enkele cellen van. Verzamel alle cellen in de buis van 50 milliliter en centrifugeer ze met de snelheid en verzamel vervolgens alle per platen.Probeer ze altijd in het koude ijs te houden. Maak de eencellige suspensies en tel ze met de celteller. Meestal de hepatocyten als ze gelukkig zijn, heeft het de levendige fluorescerende.Het tweede deel proberen we de cellen te plaatsen en de organoïde cultuur te doen. We verzamelen alle cellen suspensies, en tellen de cellen met een bepaalde concentro-fusie En dan mengen we de. Metrogels. en het codemedium.Meestal nemen we, met het medium en de metrogels, in de verhouding van 1 tot 2 of 1 tot 3. Nadat we ze zorgvuldig hebben gemengd, plaatsen we ze op de gradiëntplaten. We voegen meestal 100 microliter toe aan de 24 plaatput.Doe ze in de couveuse bij een temperatuur van 37 graden. Na 20 minuten zetten we ze omgekeerd naar voren met de onderkant aan de onderkant en vervolgens aan het medium. Met twee of drie dagen tegen de rug zien we meestal de organoïden naar buiten komen.Dit is het typische beeld van onze organoïden. We hebben meestal enkele cellen van organoïden nodig als we de passage willen doen of een genetische modificatiemethode willen doen We verzamelen alle organoïden van de tegenplaten met de wasbuffer. We laten het supernatant vallen, dan bij de wasbuffer in de plaat, mengen ze, dus pep het op en neer.En dan wassen we meestal alle tips voor met de wastapes buffer. Om te voorkomen dat alle organoïden op de uiteinden tippen. En dan met de, een nieuwe partij op ijs of zonder, verzamelen we alle organoïden door centro-fusie.We behandelen ze, er is een conning radients om alle metrogels te verwijderen. Na 20 tot 30 minuten incubatie op ijs worden alle metrogels verwijderd. We verzamelen alle schone organoïden en voegen trypsine toe om er enkele cellen van te maken.Nadat trypsine is toegevoegd, behandelen we de organoïden in de incubator. Het duurt 5 tot 10 minuten voordat leverorganoïden enkele cellen worden. We voegen meer wasbuffers toe om het triplatijn te stoppen.En dan op en neer naar hen toe. Voor het optieproces kunt u ze nog een keer wassen om alle trypsine te verwijderen. Na het wassen door centrofusie kunnen we ze onder de celteller tellen.Vervolgens zullen we laten zien hoe we transactie of transfectie van deze hepatocytenorganoïden kunnen doen. Label eerst de buizen van wat u gaat doen en vervolgens doen we de transfectie van het gezichtsvermogen volgens de instructies van de fabrikant. Je hebt, de regent van lipoyl fact taming INI MaX.We voegen de. controle en het specifieke gen siRNA, en incubateer ze met het optimum, volgens de instructies van de fabrikant. En dan voegen we volgens de celconcentratie de RAN max toe en mengen ze grondig.Dan voegen we ook de RAN max met het optimum apart toe en zetten ze op ijs. Na 5 minuten pepten we een apart RAN max-mengsel op met verschillende siRNA's, specifieke gen-RANi en II-controle afzonderlijk en mengen ze grondig. Zet ze weer op ijs, en dan verzamelen we alle organoïden, vertragen de centrofusie, laten al het supernatant vallen, we voegen de RNAi max, het siRNA-mengsel toe aan deze celplaat en pepen het grondig op en neer.Kortom, de cellen en het label RNAi max en siRNA-mengsel waren gentrificatie en incuberen gedurende 4 tot 5 uur bij 37 graden. Laatste deel, deze hepatocyten organoïden kunnen ook worden geïnfecteerd door het Lenti-virus. De vergelijkbare boodschap werd uitgevoerd als siRNA-transfectie.De controle en de siRNA-virusbuizen waren goed voorbereid, en het optimum werd toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Dan met de infectiegebieden zoals polygroen en dan voegen we verschillende Lenti-virus toe, volgens de instructies van de fabrikant. Combineer de eencellige suspensies in organoïdencultuur en verschillende deeltjes in de eppendorfbuizen van 1,5 milliliter, voeg toe, nou ja, meng ze Plaat dit mengsel en concentreer ze gedurende 1 uur op 32 graden.De concentraatfusie zal worden uitgevoerd bij 500 G.En na 4 tot 5 uur incubatie bij 37 graden zal de celsuspensie dan worden verzameld en in metrogel worden gezeten. En zet ze weer in de couveuse. Het orgaan op de formatie-efficiëntie of andere functionele analyse kon 7 tot 10 dagen later worden uitgevoerd.Hier zijn onze representatieve resultaten. In figuur 1A kon je onze ALB-Cre Rosa 26-GFP of RFP hepatocyten organoïde van muis zien. In figuur 1B kon je het Ki67 positieve signaal in kleuring zien, wat heeft aangetoond dat onze hepatocyten organoïden zich vermenigvuldigen.In figuur 2A en 2B staat hier een representatieve genexpressie van onze storende expressie van onze genen. Na genetische manipulatie in hepatocytenorganoïden is het interfererende effect zeer efficiënt. Hier is figuur 2C, je zou kunnen zien na genetische manipulatie met carsoniettechnologie in onze muizenorganoïden.Concluderend toonden onze resultaten aan dat de hepatocyten organoïden in vitro konden worden uitgebreid en genetisch gemanipuleerd. Samenvattend laten we in deze video zien hoe je de leverperfusie en spijsvertering kunt doen om de hepatocyten te krijgen. Hoe de hepatocyten te vangen en de hepatocytenorganoïden te passeren.Ook lieten we zien hoe we de siRNA- en vectortransfectie of Lenti-virusinfectie konden doen om de modificatie van de genetica van deze organoïden te doen. Ook hebben we twee tekorten aan onze organoïden. Ten eerste gebruikten we niet per kern of bontkern om de hepatocyten te zuiveren.En ten tweede denk ik dat er meer groeifactoren en signalering moeten worden geprobeerd om de groeitijd van de organoïden te verbeteren.