工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

治療上重要な細胞受容体に特異的なリガンドを同定することは、新しい治療薬の設計と開発を含む多くの用途にとって極めて重要である。マス関連Gタンパク質受容体X2(MRGPRX2)は、肥満細胞の活性化を調節する重要な受容体であり、したがって、一般的な免疫応答を導く。MRGPRX2に対する多数のリガンドが同定されており、PMP、ディフェンシン、LL-37および他のタンパク質断片(すなわち、分解されたアルブミン)のような内因性ペプチドが含まれる。MRGPRX2特異的リガンドのさらなる同定には、多数のペプチド(すなわち、ペプチドライブラリー)のスクリーニングが必要である。しかし、肥満細胞は インビトロ で維持するのが難しく高価であり、したがって、多数の分子をスクリーニングするために使用することは経済的ではない。本論文は、MRGPRX2を用いてHEK細胞を発現する小ペプチド分子のライブラリーを設計、開発、およびスクリーニングする方法を示す。この細胞株は維持するために比較的容易で安価であり 、in vitro ハイスループット分析に使用することができる。活性化時に細胞内カルシウムフラックスをマークするカルシウム感受性フラ2蛍光色素を使用して、活性化を監視した。340nmおよび380nmの励起波長に対する510nmにおけるフラ-2の蛍光強度の比を用いてカルシウム濃度を算出した。このシステムを検証するために使用されるペプチドライブラリーは、内因性のproadrenomedullin N末端12(PAMP-12)分泌基化に基づいており、MRGPRX2を高い特異性および親和性で結合することが知られている。その後のペプチドは、PAMP-12に適用されるアミノ酸切り捨ておよびアラニンスキャン技術を介して生成された。ここで説明する方法は、結合ドメインおよび受容体活性化において重要な役割を果たす他の重要なパラメータを同定するために、化合物の大規模なライブラリをスクリーニングするための簡単で安価でありながら堅牢である。