Agradecemos a la instalación de ciencia de proteínas (PSF) en el Instituto Karolinska por la expresión y purificación de la ARN polimerasa T7 y E. coli RNasa H, Martin Hällberg por el generoso regalo de la fosfatasa inorgánica, y a todo petzoldlab por las valiosas discusiones. Agradecemos a Luca Retattino por la preparación de las construcciones de U-bulge y a Emilie Steiner y Carolina Fontana por su contribución a las macros y los scripts de ajuste. Reconocemos al Instituto Karolinska y al Departamento de Bioquímica Médica y Biofísica por el apoyo a la compra de un espectrómetro de 600 MHz y la financiación de la posición (KI FoAss y KID 2-3707/2013). Agradecemos la contribución financiera de Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 y FFL15-0178) y The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 y 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 y M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. reconoce la financiación a través de un Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF project no. 747446).

K.P. es consultor de Arrakis Therapeutics, una compañía que descubre pequeñas moléculas dirigidas al ARN.

El protocolo presentado en este documento es una síntesis de varios protocolos publicados previamente en forma de artículos de investigación10,20,21,31. Por lo tanto, se pueden aplicar segmentos del protocolo, mientras que otros se pueden intercambiar a la preferencia del lector. Por ejemplo, las mediciones de R1ρ se pueden realizar en una muestra de ARN producida con cualquier método, dado que se asume el plegamiento y la homogeneidad de la longitud. Además, el protocolo no contiene información sobre la asignación de resonancia de la secuencia de ARN, un paso requerido para los experimentos de RD, ya que esto se ha cubierto ampliamente en la literatura anterior19,37,38. Los esquemas de etiquetado parciales, segmentarias o específicos del sitio36,41,42,43,44 son enfoques para facilitar la asignación de resonancia o reducir la superposición de resonancias que son de interés en los experimentos de RD y se han descrito extensamente en la literatura. Este método permite el uso de un etiquetado uniforme de cualquier identidad de nucleótido, lo que ya puede simplificar significativamente la asignación de resonancia.
El método ivT presentado aquí supera los problemas conocidos con las secuencias y el etiquetado, aumenta el rendimiento y disminuye el costo y el tiempo de trabajo en comparación con otros métodos. El uso de la secuencia de iniciación viral reduce la necesidad de optimización de la reacción, que es un problema conocido en el campo que puede llevar mucho tiempo realizar y produce solo unas pocas copias de la transcripción en el caso de la iniciación no G. La escisión T7 IVT y RNasa H de la transcripción en tándem se puede realizar simultáneamente en el mismo vaso. Se puede ver un patrón de repeticiones en tándem multiméricas en un gel PAGE desnaturalización durante la reacción, que se fusiona a una sola banda en el ARN objetivo al completar la reacción de la RNasa H(Figura 3A,carriles 1 y 2b). Los rendimientos típicos utilizando este método oscilan entre 30 y 70 nmol de ARN por 1 ml de IVT. Sin embargo, el método basado en la escisión RNasa H de repeticiones en tándem no viene sin ciertos problemas propios. La reacción de escisión de la RNasa H a menudo no se completa cuando se ejecuta simultáneamente con la transcripción T7(Figura 3A,carril 2a).
La separación de las unidades en tándem se puede finalizar recociendo la guía de escisión de la transcripción y agregando más RNasa H(Figura 3A,carril 2b, paso 2.1.2). Como el calentamiento de grandes volúmenes es lento y conduce a la hidrólisis catalizada por Mg2+del ARN, se utilizó un horno de microondas convencional, que calienta la muestra a >95 ° C en 10-15 s. Hasta el momento no se han observado efectos adversos en las muestras producidas. Algunos constructos muestran una segunda banda menor que no pudo ser eliminada por la optimización de las condiciones de reacción(Figura 3A,carril 4). Por lo general, estos son bastante claramente visibles como un hombro en el cromatograma HPLC, si se utiliza un gradiente de elución bien optimizado, y se pueden eliminar (paso 2.2.5). La siguiente discusión tiene como objetivo resaltar los pasos críticos en el protocolo, específicamente con respecto a la obtención de datos de alta calidad que permitan una interpretación de la dinámica conformacional.
Contaminación por RNasa Las RNasas extracelulares son ubicuas, altamente estables y representan la mayor amenaza para la estabilidad a largo plazo de las muestras de RMN. Por lo tanto, es crucial trabajar en un entorno libre de RNasa y mantener todos los reactivos y artículos de plástico libres de RNasa. Se recomienda el uso de puntas de filtro y tal vez incluso máscaras faciales. Esto es específicamente importante después de la purificación de HPLC. Las muestras de RMN contaminadas con RNasas generalmente exhiben picos estrechos visibles en espectros 1H-1D después de días o semanas debido a productos de degradación de un solo nucleótido. Dicha muestra no es adecuada para mediciones de R1ρ. 
Muestra de RMN Debido a su naturaleza altamente cargada, el ARN se puede utilizar en altas concentraciones sin precipitación en comparación con la mayoría de las proteínas. El uso de tubos de RMN Shigemi (consulte la Tabla de materiales)es ventajoso, ya que permiten centrar la muestra altamente concentrada en el centro de la bobina, al tiempo que proporcionan condiciones ideales de ajuste y bloqueo debido a la susceptibilidad del fondo de vidrio y el émbolo. De esta manera, la inhomogeneidad B1 se reduce, dando lugar a líneas más estrechas. El volumen de muestra típico en un tubo de RMN es de 250 μL, y la concentración típica es de 1-2 mM. Las muestras por debajo de 500 μM no se recomiendan para experimentos de RD, ya que el experimento tomaría demasiado tiempo y una buena shim. Del mismo modo, no se recomienda un volumen de muestra por debajo de 200 μL porque se requiere una buena estabilidad de shim y campo (bloqueo). Al insertar el émbolo, es crucial evitar la formación de burbujas en la muestra (paso 2.4.5). Si no se fija correctamente, el émbolo puede deslizarse hacia abajo en la muestra, reduciendo el volumen detectable. Además, los cambios rápidos de temperatura pueden conducir a la formación de nuevas burbujas en la muestra. Por lo tanto, se debe tener cuidado al transportar la muestra y al cambiar la temperatura de la sonda en el espectrómetro de RMN. Compruebe si hay burbujas en la muestra cuando vuelva a medirla después de un período más largo.
Plegamiento de ARN Las moléculas dinámicas de ARN pueden existir en múltiples conformaciones cuando no se pliegan correctamente. A pesar de que las temperaturas de fusión de las estructuras secundarias pueden ser solo ligeramente superiores a la temperatura ambiente, se recomienda un procedimiento completo de calentamiento y enfriamiento por broche antes de la medición. Las muestras de horquilla altamente concentradas que se pliegan bajo control cinético (calentamiento y enfriamiento por presión) pueden formar homodímeros con el tiempo, lo que requiere un control riguroso del plegamiento de ARN antes de cada medición de RMN. Si el ARN medido no es una estructura de horquilla sino un DÚPLEX de ARN, se debe aplicar un plegamiento lento bajo control termodinámico.
En este caso, el proceso de enfriamiento después del calentamiento debe estar en el rango de horas, mientras que el ARN se utiliza en su volumen final y concentración en la muestra de RMN. Un recuento inicial de imino esperado y resonancias aromáticas puede proporcionar información sobre la homogeneidad de la muestra. Si la muestra no se ve como se esperaba, debe volver a plegarse. Mg2+ (añadido como sal de cloruro) puede ayudar con el plegamiento de las estructuras de ARN45. En la práctica, el control de plegamiento sirve como comparación con una muestra que se ha utilizado para asignar al menos parcialmente las resonancias de RMN y para resolver la estructura secundaria experimentalmente.
Consideraciones sobre la potencia de bloqueo de giro y la calefacción En caso de ejecutar los experimentos 1H R1ρ RD como experimentos de visión general 2D, la potencia SL no debe ser inferior a 1,2 kHz. La frecuencia del transmisor de radiofrecuencia debe colocarse en el centro de la región ppm de los picos de interés(por ejemplo,7,5 ppm para protones aromáticos). El ancho de banda de 1,2 kHz será lo suficientemente grande como para bloquear estos protones sin ningún efecto importante fuera de resonancia. Tales efectos se pueden identificar en el perfil de RD. Si ocurren, los valores de R2+REX aumentan en lugar de disminuir con el aumento de los valores de potencia SL, especialmente para baja potencia SL. Compruebe si los valores de potencia SL calculados corresponden a la potencia entregada a la muestra. En la práctica, la potencia SL calculada se puede utilizar si el pulso duro de 1H 90 ° se calibró cuidadosamente en espectrómetros más nuevos; sin embargo, esto se puede comprobar calibrando la potencia SL para cada ancho de banda deseado.
El rango de potencia SL, que se puede utilizar en experimentos de 1H R1ρ RD es muy amplio, lo que lleva a un calentamiento de muestra variable (1,2 kHz a 15 kHz para HSQC para secuencias basadas en HCP y de 50 Hz a 15 kHz para experimentos SELOPE). El calentamiento desigual de la muestra se puede detectar como un ligero cambio en el cambio químico al comparar las 1D obtenidas para SL de baja potencia frente a. SLs de alta potencia. Este efecto generalmente no se considera en compensaciones de calor en experimentos R1ρ sobre heteronúcleos. La compensación de calor en esos experimentos generalmente se configura para corregir diferentes calentamientos debido a las diferentes duraciones de bloqueo de giro especificadas en la lista vd de cada serie de potencia de bloqueo de giro. Especialmente para el experimento SELOPE, se debe utilizar una segunda compensación de calor en todas las concentraciones SL aplicadas como se describe en20.
Consideraciones sobre la lista vd Como se mencionó anteriormente, la lista vd debe contener un punto de tiempo lo suficientemente largo como para obtener una desintegración significativa de intensidad (idealmente hasta el 30% de la señal inicial, o lo más baja posible si no es posible alcanzar una desintegración del 70% dentro de las especificaciones de la sonda). Aunque la lista vd se optimizó para una potencia SL baja (1,2 kHz), esta lista vd también debe probarse a la potencia SL más alta que se utilizará(por ejemplo,15 kHz). Esto se debe al hecho de que para picos con una contribución significativa de REX, la descomposición será mucho más lenta a alta potencia SL. Por lo tanto, también se debe verificar una descomposición suficiente a alta potencia SL. Lo mismo debe considerarse para las desintegraciones a altas compensaciones en experimentos fuera de resonancia. El punto de tiempo máximo ideal de la lista vd podría ser significativamente diferente para las diferentes regiones del experimento de dispersión. En ese caso, se podrían incluir más puntos en la lista vd, y los puntos de la lista vd más largos para una mayor potencia SL o compensaciones más altas durante el análisis, en función del BAJO SINO al que conducirán, podrían descartarse. En general, se deben considerar los puntos de lista de 5-8 vd para poder detectar artefactos potenciales que conducen a desintegraciones no exponenciales como el acoplamiento J (ver más abajo).
1D- Consideracionesde selectividad del HCP Se debe tener especial cuidado al ejecutar la versión 1D basada en HCP si hay otro pico que se superpone con el pico de interés en la dimensión 1H del experimento basado en HSQC 2D. Las transferencias basadas en HCP son muy, pero nunca 100% selectivas, y por lo tanto puede suceder que otro pico contribuya a la intensidad y el comportamiento de descomposición del pico de interés en el 1D. Una indicación para esto sería una diferencia en los valores de R1ρ en resonancia obtenidos utilizando las versiones 1D y 2D del experimento etiquetado.
Consideraciones sobre el ROE: Para curvas fuera de resonancia de átomos con intercambio intermedio lento, los artefactos ROE se pueden identificar basándose en una comparación del Δω obtenido con un espectro NOESY o ROESY. Si se puede identificar un pico cruzado en una diferencia de desplazamiento químico correspondiente a Δω,entonces el estado excitado observado podría ser de hecho un artefacto ROE(por ejemplo,se encontraron ROE entre protones aromáticos, que están todos en el mismo rango de desplazamiento químico y, por lo tanto, cubiertos por esas curvas fuera de resonancia20). Por experiencia, esto siempre condujo a malos ajustes con grandes errores, posiblemente debido a que el ROE no siguió el mismo patrón que REX con el aumento de la potencia SL. La situación se vuelve más difícil para el intercambio intermedio-rápido. Mientras que la curva de resonancia es (a partir de la comparación con los datos de 13C obtenidos en el núcleo vecino) aún representativa del proceso de intercambio entre el GS y el ES, la curva de fuera de resonancia está influenciada por múltiples artefactos ROE.
En ese caso, la potencia SL para detectar el proceso de intercambio es mayor (>1,5 kHz) y, por lo tanto, abarca un mayor número de protones a medida que las curvas fuera de resonancia abarcan las diferencias de desplazamiento químico de varios candidatos ROE (para H8 estos serían: amino protones a ca. ±1000 Hz, H5 / H1 a ca. -1200 Hz, protones imino a ca. 3500 Hz). Hasta ahora, no se ha encontrado ningún método para suprimir estos artefactos ROE (aparte del uso de nucleótidos parcialmente deuterados46),y los datos fuera de resonancia no deben registrarse para el intercambio intermedio rápido, ya que no se puede extraer información confiable sobre el Δω real con este método, si no se puede excluir la contribución NOE / ROE a través de espectros NOESY.
Consideraciones de J-Coupling (Hartmann-Hahn) Aunque las curvas de resonancia para protones homonucleares acoplados a J, como H6, se registraron con éxito10,20, se debe tener especial cuidado para las mediciones fuera de resonancia, especialmente para la baja potencia SL, ya que las condiciones de coincidencia Hartmann-Hahn pueden abarcar una amplia gama de las compensaciones investigadas. Los artefactos de Hartmann-Hahn se pueden identificar como oscilaciones en la desintegración exponencial o valores crecientes de R2+REX con fuerzas SL crecientes en gráficos RD en resonancia20.

Los ARN realizan una multitud de funciones reguladoras1,catalíticas 2y estructurales3 en la célula, muchas de las cuales están correlacionadas con una estructura molecular flexible y cambios intrincados de esas estructuras4,5,6,7. Los estados poco poblados permanecen invisibles para la mayoría de los métodos de determinación de estructuras o no permiten el estudio de estos estados ocultos a alta resolución atómica. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de estado de solución combina ambos aspectos al proporcionar acceso a núcleos atómicos individuales, así como al ofrecer una gran caja de herramientas de experimentos dirigidos a la dinámica a través de todos los regímenes de tiempo8. Los experimentos de RMN RD proporcionan acceso al intercambio conformacional en la escala de tiempo intermedia, en la que se pueden esperar cambios en los patrones de emparejamiento de bases y reordenamientos estructurales locales5,9,10,11 , 12,13,14. Los experimentos de RD se realizan como mediciones largas de R2 en forma de un tren de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill15 o como mediciones de relajación en el marco giratorio, llamados experimentos R1ρ RD16.
Aunque ambos se pueden usar para extraer la población y el tipo de cambio y la diferencia de cambio químico al estado menor, los experimentos R1ρ RD también dan el signo de la diferencia de cambio químico del estado excitado. Esto permite una inferencia sobre la estructura secundaria, que se correlaciona fuertemente con el cambio químico en las estructuras de ARN17. El cambio químico es un buen indicador de helicidad en el caso de protones y carbonos aromáticos en las nucleobases, de socios de emparejamiento de bases para protones imino y de fruncidos de azúcar en los átomos C4' y C1'18,19. Cabe señalar que recientemente se publicó un experimento de transferencia de saturación de intercambio químico (CEST) que utiliza una mayor potencia de bloqueo de espín (SL), cambiando así la aplicabilidad del experimento CEST a escalas de tiempo de intercambio más rápidas, como una alternativa al experimento R1ρ RD para sistemas con un estado excitado.
Aunque los isótopos de 13C y 15N se han utilizado a menudo para acceder al intercambio estructural, trabajos recientes de este laboratorio utilizaron protones aromáticos e imino como sondas para el intercambio conformacional9,10. El uso de 1H como núcleo observado trae varias ventajas, por ejemplo, acceso al intercambio en escalas de tiempo más rápidas y lentas, mayor sensibilidad y tiempos de medición más cortos. Esto se ve facilitado aún más por el enfoque SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), que proporciona acceso a protones aromáticos a través del descroxing del espectro unidimensional (1D) utilizando acoplamientos escalares homonucleares, en lugar de una transferencia de magnetización heteronuclear, y eliminando la necesidad de etiquetas de isótopos20. Este protocolo aborda la medición en experimentos de 1H R1ρ RD de muestras uniformemente etiquetadas con 13 C/15N y sin etiquetar. Por lo tanto, este artículo presenta un método de preparación de muestras que se encontró que es el más versátil para diferentes necesidades de preparación de muestras21 y discute alternativas en la última sección de este artículo(Figura 1).
En este punto, el lector debe tener en cuenta que otras técnicas de preparación de muestras son aceptables para los experimentos 1H R1ρ RD, y que se pueden realizar otros métodos de análisis estructural y funcional con las muestras sintetizadas con la técnica presentada. 1 Los experimentos H R1ρ RD requieren altas concentraciones de ARN (idealmente >1 mM), así como una alta homogeneidad, tanto en longitud de ARN como en conformación estructural para garantizar una caracterización confiable de la dinámica molecular. La transcripción in vitro (IVT) es el método de elección para muchos investigadores para producir 13muestras de ARN C/15N-labeladas debido a la disponibilidad de trifosfatos nucleósidos (NTP) etiquetados y la incorporación fácil en la reacción enzimática22. Sin embargo, la ampliamente utilizada ARN polimerasa T7 (T7RNAP)23,24,25 sufre de baja homogeneidad de 5' en caso de ciertas secuencias de iniciación26, 27 y a menudo también homogeneidad de 3' durante la escorrentía de transcripción28. La purificación de las especies de ARN objetivo se vuelve más costosa y laboriosa debido a la necesidad de grandes cantidades de ~ 200 nmol. El método utilizado aquí se ha presentado anteriormente donde se discutieron las ventajas en general21. En resumen, resuelve los problemas descritos transcribiendo una transcripción en tándem más grande que luego es escindida específicamente por Escherichia coli RNasa H, guiada por un oligonucleótido quimérico29,30 (ver Figura 2 para más detalles).
La incorporación de una secuencia espaciadora en los extremos 5' y 3' de la transcripción en tándem permite el uso de una secuencia de iniciación de alto rendimiento y la eliminación de voladizos terminales cerca del sitio de linealización de la plantilla de plásmido, respectivamente (Figura 2B). Se demostró que el método mejora significativamente los rendimientos, al tiempo que reduce el costo y la mano de obra, con la advertencia de una síntesis de plantilla más compleja y la necesidad de una enzima y oligonucleótido adicionales. La alta especificidad de la escisión de la RNasa H facilita la purificación debido a la falta de especies de ARN en un rango de tamaño similar. El presente protocolo utiliza un paso de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de intercambio iónico que ha sido publicado por este laboratorio recientemente31,aunque otros métodos son posibles alternativas. 1 H R1ρ RD puede, en general, adquirirse en muestras etiquetadas o no etiquetadas con dos secuencias de pulsos respectivas, el experimento basado en la correlación cuántica única heteronuclear (HSQC) "etiquetado" 1 H R1ρ con una dimensión indirecta 10de13 C y el experimento basado en 10indirectos "noetiquetado" 1 H R1ρ basado en SELOPE con una dimensión indirecta de 1H20.
Estos experimentos bidimensionales (2D) pueden servir como una primera comprobación, independientemente de si la dinámica en la escala de tiempo R1ρ está presente en la muestra. Se puede obtener una visión general de rd para todos los picos resueltos en los espectros, y se pueden identificar picos de interés para un análisis de RD más exhaustivo. Esto significa que incluso las muestras no etiquetadas se pueden verificar antes de tomar la decisión de producir una muestra etiquetada más costosa. Una vez que se selecciona un pico con contribución de intercambio conformacional para ser estudiado más a fondo, es mejor cambiar a las versiones 1D de los experimentos anteriores (si el pico aún se puede resolver) para llevar a cabo los llamados experimentos fuera de resonancia. Para la versión etiquetada, la transferencia HSQC a 13C se reemplaza con un paso selectivo de polarización cruzada heteronuclear (HCP) como se usa en los experimentos 13C R1ρ 32 , 33,34,35,mientras que en el caso del experimento SELOPE, el experimento simplemente se ejecuta como un 1D, lo que es especialmente útil para las señales H8 y H2 que se encuentran en la diagonal en el 2D de todos modos. Un criterio en cuanto a qué secuencia utilizar, siempre que se disponga de una muestra etiquetada y no etiquetada, es qué tan bien aislado está el pico de interés en los dos experimentos.
En general, el experimento SELOPE se recomienda para muestras de ARN de hasta 50 nucleótidos. Para los ARN más grandes, la superposición será mayor; sin embargo, los nucleótidos estructuralmente interesantes a menudo aparecen en regiones de cambio químico que están menos superpuestas y aún podrían ser accesibles en ARN aún más grandes. Otro argumento sería que en muestras no etiquetadas, no se produce ningún acoplamiento en J entre 1H y 12C. Sin embargo, como la potencia mínima de bloqueo de giro se define por la potencia mínima utilizada para desacoplar esos dos giros (~ 1 kHz) en el experimento etiquetado, el experimento sin etiquetar permite el uso de un rango más amplio de intensidades de bloqueo de giro (SL) y, por lo tanto, el acceso a una escala de tiempo de intercambio más amplia. Estos experimentos fuera de resonancia proporcionan información adicional a kex, como la población del estado excitado (conformador alternativo), pES, así como información de cambio químico muy valiosa en forma de Δω (la diferencia de cambio químico del estado fundamental y el estado excitado).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo presentado. Preparación antes de la producción real de muestras a gran escala, que consiste en la preparación de plantillas y la confirmación de la transcripción in vitro exitosa y la escisión de la RNasa H. Producción a gran escala, incluida la purificación de HPLC, el llenado del tubo de RMN y la confirmación del plegamiento de ARN. En caso de síntesis etiquetada con isótopos, se debe realizar una purificación sin etiquetar para la optimización del gradiente el mismo día. Caracterización por RMN de la dinámica conformacional con experimentos R1ρ. Cada paso se puede realizar de forma independiente, por ejemplo,el análisis 1H R1ρ RD se puede aplicar a cualquier muestra de ARN adecuada producida con otro método. Abreviaturas: IVT = transcripción in vitro; HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; RMN = resonancia magnética nuclear; RD = dispersión de relajación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El objetivo de este protocolo es proporcionar detalles prácticos y parámetros críticos para el estudio de la dinámica conformacional con dispersiónde relajación 1 H R1ρ en moléculas de horquilla de ARN. Después de proporcionar un protocolo detallado del diseño, la síntesis y la purificación de HPLC de intercambio iónico de un ARN objetivo que se puede realizar utilizando todos, algunos o ninguno NTP como versiones etiquetadas con 13C /15N, se ha descrito el flujo de trabajo de finalizar la muestra de RMN y confirmar el intercambio conformacional con espectroscopia de RMN. Finalmente, se describen los detalles para la configuración de 1experimentos H R1ρ RD en un espectrómetro bruker NMR (Figura 1). El protocolo da cada paso para configurar la versión 1D para muestras etiquetadas y comentarios adicionales y una tabla para ajustar para la configuración de la versión SELOPE (Tabla 2). Después del protocolo, se discuten los pasos críticos y las rutas alternativas para la preparación de la muestra y la configuración de 1H R1ρ RD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

El ARN es una biomolécula altamente flexible, en la que los cambios en las estructuras juegan un papel crucial en las funciones que las moléculas de ARN ejecutan como mensajeros y moduladores celulares. Si bien estos estados dinámicos permanecen ocultos para la mayoría de los métodos estructurales, la espectroscopia de dispersión de relajación (RD) R1ρ permite el estudio de la dinámica conformacional en el régimen de micro a milisegundos a resolución atómica. El uso de 1H como núcleo observado amplía aún más el régimen de tiempo cubierto y da acceso directo a los enlaces de hidrógeno y al emparejamiento de bases.
Los pasos desafiantes en dicho estudio son la preparación de muestras de alta pureza y alto rendimiento, potencialmente etiquetadas con 13C y 15N, así como la configuración de experimentos y el ajuste de datos para extraer población, tipo de cambio y estructura secundaria del estado previamente invisible. Este protocolo proporciona pasos prácticos cruciales en la preparación de muestras para garantizar la preparación de una muestra de ARN adecuada y la configuración de 1experimentos H R1ρ con muestras de ARN etiquetadas isotópicamente y no etiquetadas.

El protocolo para la producción de ARN facilita la purificación a través de la generación de transcripciones de alta pureza. La Figura 3A muestra los resultados de varias reacciones de escisión de transcripciones en tándem, proporcionando reacciones exitosas y no exitosas. El carril 1 muestra el caso óptimo de una transcripción completamente escindida con solo rastros débiles de productos secundarios. El carril 2a muestra una escisión incompleta, que puede resolverse recocido y la adición de más RNasa H (Carril 2b, paso 2.1.2). Las construcciones de ARN de los carriles 1, 2a y 2b son las mismas. La muestra en el carril 3 muestra una escisión fallida. La solución de problemas de esta reacción implicaría una verificación de la secuencia de la guía de escisión, la pureza de la plantilla de ADN y las temperaturas de recocido. Potencialmente, la escisión de la RNasa H tendrá que realizarse después de la IVT T7 como se muestra en la muestra 2.
La muestra en el carril 4 muestra una cantidad significativa de productos laterales de escisión, que son difíciles de eliminar a través de HPLC de intercambio iónico. La solución de problemas de dicha muestra puede implicar (a) reducir la temperatura, la cantidad de RNasa H o el tiempo de reacción, (b) reducir el gradiente de elución y el volumen de inyección e intentar separar las fracciones objetivo de los productos secundarios. Karlsson et al.31han discutido más información sobre cómo aumentar la resolución en la purificación de HPLC en intercambio iónico. HpLC separa el ARN objetivo de ácidos nucleicos más largos o más cortos y contaminantes de proteínas o moléculas pequeñas. La Figura 3B muestra el resultado óptimo para la purificación de HPLC de intercambio iónico. El gradiente de elución debe elegirse de tal manera que la especie de ARN objetivo eluye al menos un volumen de columna (en este ejemplo: 35 ml) después de la siguiente especie más pequeña y un volumen de columna antes de la siguiente especie más grande.
Las especies más pequeñas en este método incluyen nucleótidos individuales, productos abortivos (8-12 nt), secuencias espaciadores de 3' y 5' (5-14 nt) y guía de escisión (ácido nucleico quimérico de 12 nt), mientras que las secuencias más largas son potencialmente repeticiones en tándem y el plásmido. Cuando se alcanza un pico de elución bien separado, la purificación se puede escalar hasta el equivalente a ~ 20 ml de reacción ivT por inyección. El pliegue correcto de una muestra de ARN es crucial para los experimentos de RD y debe confirmarse antes de cada medición. La Figura 4 muestra un ARN de 22 mer con etiqueta A antes de que se aplicara el protocolo de plegado en el paso 2.4 (azul), y la misma muestra después de que se haya logrado el plegamiento correcto (rojo). Una predicción de estructura secundaria mc-fold(Figura 4C)propone la estructura de horquilla presentada con 4 pares de bases que resultan en 5 señales imino.
Ambos espectros en la Figura 4A confirman estas señales predichas, aunque con intensidades relativas ligeramente diferentes, lo que indica que alguna estructura mal plegada (aquí, un dímero) puede ser problemática para evaluar con solo 1espectro H 1D. Un espectro aromático de 1H,13C-HSQC(Figura 4B),sin embargo, muestra solo 3 de las señales aromáticas para la muestra antes del protocolo de plegado (azul), pero las 4 señales para la muestra que se ha plegado de acuerdo con el paso 2.4 (rojo). La muestra mostrada en azul probablemente formó un homodímero (estructura propuesta en la Figura 4D)que daría lugar a las mismas señales de imino que la horquilla. La señal de A13H2 parece ampliada por el intercambio. Estos resultados ayudan a resaltar la importancia de la confirmación de plegado con experimentos de huellas dactilares imino y aromáticas antes de cada experimento de RD. Las secuencias de pulsos 1H R1ρ descritas en este protocolo permiten la detección de dinámicas en el régimen de intercambio intermedio. Inicialmente se registra una curva de resonancia, y si la dinámica está presente para un residuo específico, se ve una dispersión dentro de los valores R2+REX obtenidos, mientras que esta curva es plana para residuos sin intercambio.
La Figura 5 muestra curvas representativas en resonancia obtenidas para dos átomos de H8 diferentes en una horquilla de ARN sintético(Figura 5A),en la que las experiencias G6H8 se intercambian(Figura 5C),mientras que A4H8 no (Figura 5B). Como el intercambio es relativamente lento en esta muestra (kEX = 292 ± 40 Hz), se aprovechó la ventaja del experimento SELOPE para lograr bajas intensidades sl, y las dos curvas de resonancia se registraron utilizando la versión 1D de la secuencia de pulsos. Luego se utilizó la misma secuencia de pulsos para obtener datos fuera de resonancia para el residuo que muestra dispersión en el perfil de resonancia. La Figura 5D muestra los valores R1ρ obtenidos vs. offset en los que una ligera asimetría de la curva ya indica el signo de Δω.
Esto se hace aún más evidente en la gráfica R2+ REX donde se elimina la contribución R1 (Figura 5E). La columna derecha de la misma figura muestra curvas representativas de resonancia obtenidas para dos átomos H8 diferentes en una horquilla de ARN sintético ligeramente diferente con un intercambio más rápido, en las que las experiencias G6H8 se intercambian(Figura 5G),mientras que A4H8 no (Figura 5F). El tipo de cambio más rápido(kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) permitió el registro RD de todos los protones aromáticos a la vez utilizando la versión SELOPE 2D para obtener datos de on- y off-resonance (datos G6H8 mostrados en la Figura 5H,I).
Identificadores generales de resultados positivos y negativos Los resultados positivos en la escisión Tándem IVT y RNasa H se pueden identificar de la siguiente manera: 1) La banda objetivo es la banda más fuerte en el gel PAGE desnaturalización. 2) No hay o solo hay bandas débiles alrededor de la banda principal. 3) No hay o solo hay especies débiles de mayor peso molecular. 4) El cromatograma HPLC muestra un pico bien separado del ARN objetivo. 5) Cuando se muestrea el pico principal, solo aparece una banda en un gel PAGE desnaturalador.
Los resultados negativos en la escisión Tándem IVT y RNasa H se presentan de la siguiente manera: 1) No o solo se ve una banda principal débil en un gel PAGE desnaturalización. 2) Un patrón de especies de alto peso molecular a partir de repeticiones en tándem de ARN es visible. 3) Aunque la banda principal está presente, las bandas de intensidad similar están por encima o por debajo de la banda principal dentro de ± 3 nt.
Una muestra bien plegada se puede identificar de la siguiente manera: 1) El número de protones imino observados coincide con el número de protones imino esperados de una simulación de estructura secundaria(por ejemplo,Mc-Fold39, Figura 4A). 2) El par de bases oscilantes syn G-U en un bucle UUCG (si está presente) es visible a ~ 9.5 ppm, a veces solo visible a temperatura más baja. Fürtig y sus colegas han descrito otras huellas dactilares del bucle UUCG40. 3) La huella dactilar aromática concueerda con una muestra previamente asignada que se ha confirmado que se pliega correctamente(Figura 4C).
Una muestra mal plegada o degradada se puede identificar de la siguiente manera: 1) Hay más señales de imino de las que predice una simulación de estructura secundaria (NOTA: menos señales de imino no implican necesariamente un plegamiento erróneo, ya que los pares de bases de cierre a menudo no son visibles, y el intercambio conformacional amplía las líneas). 2) Ausencia de señales imino. 3) Señales estrechas de alta intensidad en la región aromática, indicando productos de degradación de nucleótidos individuales. 4) Divergencia entre señales imino o aromáticas a una muestra de referencia de plegamiento confirmado (Figura 4C).
Un átomo que no muestra ningún intercambio en la escala de tiempo detectable se puede identificar de la siguiente manera: 1) a partir de un perfil RD plano (debido a la falta de contribución REX que varía con la potencia SL aplicada)(Figura 5B y Figura 5F). 2) Se debe tener cuidado con el caso de intercambio intermedio lento cuando kEX y Δω son de la misma magnitud. En ese caso, la contribución en resonancia puede ser muy pequeña como se puede ver en la Figura 5C (en este caso los parámetros ajustados son kEX = 292 ± 40 Hz y Δω = 112 ± 4 Hz). En caso de duda, se puede registrar una curva baja sl fuera de resonancia para su verificación.
Un átomo que muestra intercambio en la escala de tiempo intermedia se puede identificar 1) a partir de un perfil de dispersión de relajación no plana en un experimento de RD en resonancia(Figura 5B y Figura 5F); 2) un ancho de línea más amplio en el experimento HSQC o SELOPE también puede ser un indicador de intercambio.
Los valores de potencia SL bien seleccionados para curvas fuera de resonancia(Figura 5E,F):1) tienen una contribución k EX considerable en la curva de resonancia (los valores de potencia SL seleccionados se indican en la Figura 5C y la Figura 5G). 2) Como las curvas fuera de resonancia se miden para al menos 3 valores de potencia SL, los valores de potencia SL seleccionados deben extenderse sobre la región de la curva de resonancia con kEX contribución. 3) Conducir a curvas R2+REX no planas después del ajuste de Laguerre (por ejemplo, Figura 5D:SL fortalezas 25, 50 y 75 Hz; Figura 5E).
Los valores de potencia SL mal seleccionados para curvas fuera de resonancia(Figura 5E,F)conducen a curvas planas R2+ REX después del ajuste de Laguerre. Un ejemplo se muestra en la Figura 5E,en el que la curva de fuera de resonancia de 100 Hz es muy plana y, por lo tanto, no proporciona información significativa sobre Δω.
Indicaciones para artefactos de efecto Overhauser (ROE) nuclear de marco giratorio: 1) Δω obtenido de curvas de resonancia fuera de coincidencia coinciden con los desplazamientos químicos de protones en vecindad espacial / protones, que muestran un pico cruzado con el pico de interés en el espectro de espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY). (por ejemplo,la Figura 5I muestra amplias curvas fuera de resonancia como se esperaba para el intercambio intermedio rápido, pero las curvas también tienen características más nítidas, por ejemplo,a -3000 Hz y +1500 Hz. Estos son muy probablemente debidos a un artefacto ROE en lugar de un cambio químico para este H8 en un conformador diferente). 2) El ajuste de Laguerre funciona, pero no funciona bien (da errores altos o valores físicamente imposibles) para una resonancia de encendido y al menos 3 curvas fuera de resonancia, a pesar de que se obtuvieron exponenciales a partir de experimentos con SINO alto (>20)(por ejemplo, kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). A menudo, cada SL encaja bien individualmente, pero encajarlos entre sí da un error mucho mayor; se espera el comportamiento opuesto para un verdadero estado excitado.
Indicaciones para el intercambio "verdadero" Δω: 1) Δω obtenido de curvas fuera de resonancia no coinciden con los desplazamientos químicos de protones en vecindad espacial / protones, que muestran un pico cruzado con el pico de interés en el espectro NOESY(por ejemplo, Figura 5E). 2) El ajuste de Laguerre da errores bajos para una resonancia de encendido y al menos 3 curvas de resonancia(por ejemplo, Figura 5E vs. Figura 5I, ver leyenda para los resultados de ajuste).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Figura 3: Producción de muestras por reacción de escisión T7 tandem IVT y RNasa H. (A) Desnaturalización PAGE de resultados positivos y negativos de Tándem IVT y RNasa H escisión. La altura de la escalera se refiere a las referencias de ARN, 12 * se refiere a la guía de escisión quimérica. Carril 1: Generación exitosa de un ARN objetivo de 20 nt. Pocos productos más cortos y largos están presentes. Carril 2a: Escisión incompleta de la transcripción en tándem. Aunque la purificación de HPLC es posible, se desperdiciaría mucho material. Carril 2b: La escisión continua de la RNasa H del Carril 2 produce una muestra limpia lista para la inyección de HPLC (idéntica al Carril 1). Carril 4: La escisión de la RNasa H no tuvo éxito en gran medida, y no se produjo ninguna banda objetivo. La transcripción en tándem de larga duración todavía es visible a 600 nt. Carril 5: Se produjo una banda objetivo, pero una banda fuerte -1 está presente. Aunque se puede realizar HPLC, es necesaria una eliminación cuidadosa del producto lateral. (B) Ejemplo de una inyección exitosa de HPLC. El pico a los 38 min contiene ARN puro de la longitud objetivo, mientras que los productos más largos y más cortos están bien separados del ARN objetivo. El Grupo B ha sido modificado a partir del 21. Abreviaturas: IVT = transcripción in vitro; HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; nt = nucleótidos; AU = unidades arbitrarias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Figura 4: Ejemplo de una horquilla de ARN antes (azul) y después (rojo) del paso de plegamiento 2.4 (ver protocolo) en RMN. (A) Región Imino de un espectro 1H-1D de un ARN 22-mer etiquetado con A. Las regiones esperadas para la identidad del par base de las señales imino se indican en gris a continuación. (B) 1H,13C-HSQC espectro de las resonancias aromáticas del ARN del panel A. La muestra después del plegado (rojo) muestra 4 señales como se esperaba, mientras que la muestra antes del plegamiento (azul) muestra solo 3 señales. (C) Predicción de Mc-Fold del ARN de 22-mer como horquilla. Cinco señales imino son de esperar de esta estructura secundaria, que se pueden encontrar en ambas muestras en el panel A. (D) Estructura propuesta de un homodímero formado por el ARN de 22-mer, dando como resultado los mismos 5 pares de bases que la estructura de horquilla. Abreviaturas: RMN = resonancia magnética nuclear; 1D = unidimensional; HSQC = correlación cuántica única heteronuclear; ppm = partes por millón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Figura. 5: 1H R1ρ Resultados representativos de RD para dos constructos diferentes basados en una horquilla de ARN. (A) La columna izquierda muestra los resultados obtenidos en el ARN con un par de bases C-G por encima de la U abultada, mientras que la columna derecha muestra los resultados obtenidos en una muestra donde el par de bases se cambió a G-C en su lugar. (B) y (F) muestran perfiles de dispersión plana como los obtenidos para A4H8 para los dos constructos, lo que indica que no hay intercambio conformacional. (C–E) muestran datos de sobrerresonancia, fuera de resonancia y ajustados obtenidos para G6 en el constructo (G-C). El ajuste de Laguerre conduce al siguiente resultado: R1 = 2.87 ± 0.01 Hz, R2 = 7.76 ± 0.03 Hz, k EX = 292 ± 40 Hz, p ES = 0.31 ± 0.03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) muestran datos de resonancia, fuera de resonancia y ajustados obtenidos para G6 en el constructo (G-C). El ajuste de Laguerre conduce al siguiente resultado: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43.502 ± 38.478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Esta cifra fue modificada de 20. Abreviatura: SL = bloqueo de giro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Presentamos un protocolo para medir la dinámica de micro a milisegundos en 13C/15N-etiquetado y no etiquetado ARN con 1H R1ρ dispersión de dispersión de relajación espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). El enfoque de este protocolo radica en la preparación de muestras de alta pureza y la configuración de experimentos de RMN.

Aspectos prácticos de la preparación de muestras y la configuración de 1H R1ρ Experimentos de dispersión de relajación de ARN

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Este protocolo describe la preparación de muestras de ARN y la configuración de RMN para las mediciones de dispersión de relajación de protones R1rho para examinar el intercambio confirmacional en moléculas de ARN. Dado que los protones sondeados, el método no necesita etiquetado isotópico y puede acceder directamente a características estructurales como el emparejamiento de bases desplazado. La pipeta es bastante modular en el sentido de que la dispersión de relajación R1rho se puede medir incluso si la muestra se produce con un método diferente.Comience preparando la muestra de plásmido y configurando una transcripción in vitro y una reacción de escisión como se describe en el manuscrito de texto. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante una hora. Luego diluya un microlitro de la muestra diez veces en solución de carga.Y ejecute un microlitro en un gel PAGE desnaturalizador. Si la reacción de escisión es exitosa, escale la reacción al volumen deseado y eótela durante la noche. A continuación, ejecute otro gel PAGE desnaturalizar y evalúe si se ha completado la reacción de escisión.En caso de escisión incompleta, caliente la solución de reacción en un microondas convencional a 450 vatios durante 15 segundos. Luego enfríe la solución lentamente a 37 grados Celsius durante 40 minutos para volver a annear el ARN y la guía de escisión. Y nótese la formación de un nuevo precipitado.Agregue más pirofosfatasa inorgánica y RNasa H.Incubar la reacción durante una a tres horas a 37 grados centígrados. A continuación, confirme la finalización de la reacción de escisión con la desnaturalización de PAGE. Cuando se complete la reacción de escisión de la RNasa H, saciar la reacción agregando EDTA a una concentración final de 50 milimolares.Y vórtice a fondo. Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. Y concentre la solución en un volumen inyectable en un sistema HPLC para su purificación.Antes de agregar la muestra concentrada y purificada al tubo de RMN, limpie el tubo enjuagando con abundante agua. Luego reactivo de descontaminación RNasa, agua y etanol al 95%. Después del enjuague final con agua, déjelo secar.Enjuague el émbolo con agua y use una toallita sin pelusa para limpiar con reactivo de descontaminación RNasa y etanol al 95%. Después de secar el tubo y el émbolo, agregue 10% D2O a la muestra de RMN. Use una punta de pipeta grande para transferir la muestra de ARN al tubo de RMN, que fluye a lo largo del lado de la pared del tubo.Inserte el émbolo en el tubo empujándolo hacia abajo con un movimiento de torsión rápido para eliminar las burbujas de aire, luego tire del émbolo hacia arriba lentamente sin crear nuevas burbujas de aire. Y arreglarlo con película de cera de parafina. Cree un nuevo conjunto de datos basado en un conjunto de datos HSQC de carbono de protones aromáticos utilizado en muestras de ARN completamente etiquetadas para la asignación de ARN.Establezca los parámetros generales y los parámetros específicos de RD. A continuación, establezca la potencia de bloqueo de espín de protones a 1,2 kilohercios para las pruebas. Genere una lista vd de prueba con solo una entrada, cero milisegundos, establezca TDF1 en uno y actualice D30 para ejecutar un espectro de prueba.Después de configurar una lista vd de prueba, actualice D30 y TDF1. Y traza la intensidad del pico para diferentes longitudes de bloqueo de giro. Identifique la longitud de bloqueo de giro a la que la intensidad del pico original disminuye a un tercio.A partir del resultado de las ejecuciones de prueba, cree la lista vd final que se utilizará en el experimento. Seleccione el número de escaneos para que el pico más débil de la lista tenga una relación señal/ruido de al menos 10. Los resultados de varias reacciones de escisión de transcripciones en tándem se muestran aquí.Se generó un ARN diana de 20 nucleótidos en una reacción exitosa. Las reacciones fallidas resultaron en una escisión incompleta y fallida de la muestra. La inyección de HPLC de la muestra de ARN reveló un pico de ARN objetivo puro a los 38 minutos.Mientras que los productos más largos y más cortos estaban bien separados del pico de interés. El análisis de la horquilla de ARN mostró que el número de protones imino observados coincidía con el número de protones imino esperados de una simulación de estructura secundaria. El espectro HSQC de carbono de protones de las resonancias aromáticas del ARN mostró cuatro señales después del plegamiento.Y solo tres señales antes de plegarse. En el representante sobre curvas de resonancia obtenidas para dos átomos de H8 diferentes y dos horquillas de ARN sintético diferentes, el G6H8 experimenta intercambio confirmacional. Mientras que el A4H8 no.Para G6H8, se seleccionaron las potencias de bloqueo de giro de color y se registraron los datos de resonancia fuera. En la construcción CG donde el intercambio es lento, los valores de la fila R1rho versus la gráfica offset ya mostraban una ligera asimetría de la curva, lo que indica el signo de la diferencia de desplazamiento químico delta omega. Esto se hace aún más evidente en la gráfica R2 más REX donde se elimina la contribución R1.Por otro lado, el constructo GC experimenta un intercambio más rápido y la gráfica de valores R1rho versus offset presentó una curva más amplia donde la extracción de delta omega se vuelve menos obvia incluso en la gráfica R2 más REX. Una vez que se ha dilucidado la dinámica del ARN, los estados pueden ser caracterizados y atrapados. Estos estados atrapados pueden, por ejemplo, ser probados en ensayos biológicos.Este método nos permite observar cambios funcionales y relevantes de emparejamiento de bases en un complejo activo de microARN miRNA, reordenamientos de asa en ARN ribosómico y estabilidad de pares de bases de protuberancias de un solo nucleótido.