Karolinska Institutet'teki protein bilimi tesisine (PSF) T7 RNA polimerazının ve E. coli RNase H'nin ifade ve saflaştırılması için, Martin Hällberg'e inorganik fosfatazın cömert hediyesi için ve tüm Petzoldlab'a değerli tartışmalar için teşekkür ederiz. U-bulge yapılarının hazırlanması için Luca Retattino'ya ve makrolara ve uygun komut dosyalarına katkılarından dolayı Emilie Steiner ve Carolina Fontana'ya teşekkür ederiz. Karolinska Enstitüsü ve Tıbbi Biyokimya ve Biyofizik Bölümü'nü 600 MHz spektrometre ve pozisyon finansmanı (KI FoAss ve KID 2-3707/2013) satın alımını desteklemek için kabul ediyoruz. Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 ve FFL15-0178) ve Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse'nin (J) finansal katkıları için minnettarız.S20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 ve 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 ve M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. Marie Skłodowska-Curie IF (AB H2020, MSCA-IF proje no. 747446).

K.P., RNA'yı hedefleyen küçük molekülleri keşfeden Arrakis Therapeutics şirketinin danışmanıdır.

Burada sunulan protokol, daha önce 10,20 ,21,31araştırma makaleleri şeklinde yayınlanan çeşitli protokollerin bir sentezidir. Bu nedenle, protokolün bölümleri uygulanabilirken, diğerleri okuyucunun tercihine değiştirilebilir. Örneğin, R1φ ölçümleri, katlama ve homojenlik uzunluğu varsayıldığı göz önüne alındığında, herhangi bir yöntemle üretilen bir RNA numunesi üzerinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, protokol RNA dizisinin rezonans ataması hakkında bilgi içermez-RD deneyleri için gerekli bir adım- bu önceki literatür19,37,38'dekapsamlı bir şekilde ele alınmıştır. Kısmi, segmental veya siteye özgü etiketleme şemaları36,41,42,43,44, rezonans atamasını kolaylaştırmak veya RD deneylerinde ilgi çekici olan ve literatürde uzun uzadıya açıklanan rezonansların çakışmasını azaltmak için yaklaşımlardır. Bu yöntem, rezonans atamasını önemli ölçüde basitleştirebilen herhangi bir nükleotid kimliğinin tekdüze etiketlemesinin kullanılmasına izin verir.
Burada sunulan IVT yöntemi, diziler ve etiketleme ile bilinen sorunların üstesinden gelir, verimi artırır ve maliyet ve çalışma süresini diğer yöntemlere göre azaltır. Viral başlatma dizisinin kullanımı reaksiyon optimizasyonu ihtiyacını azaltır, bu da alanda yapılması zaman alıcı olabilen bilinen bir sorundur ve G olmayan başlatma durumunda transkriptin sadece birkaç kopyasını verir. Tandem transkriptin T7 IVT ve RNase H dekoltesi aynı kapta aynı anda yapılabilir. Reaksiyon sırasında, RNase H reaksiyonunun tamamlanmasıyla hedef RNA'da tek bir bantta birleşen denatüre page jel üzerinde multimerik tandem tekrarlarının bir deseni görülebilir(Şekil 3A, şeritler 1 ve 2b). Bu yöntemi kullanan tipik verimler 1 mL IVT başına 30 ila 70 nmol RNA arasında değişmektedir. Yine de, tandem tekrarlarının RNase H bölünmesine dayanan yöntem, kendi başına belirli sorunlar olmadan gelmez. RNase H bölünme reaksiyoni genellikle T7 transkripsiyon ile aynı anda çalıştırıldığında tamamlanmaz(Şekil 3A, şerit 2a).
Tandem ünitelerin ayrılması, transkript için dekolte kılavuzu tavlanarak ve daha fazla RNase H eklenerek sonlandırılabilir(Şekil 3A, şerit 2b, adım 2.1.2). Büyük hacimlerin ısıtılması yavaş olduğundan ve RNA'nın Mg2+katalizli hidrolizine yol açtığından, numuneyi 10-15 s'de >95 ° C'ye ısıtan geleneksel bir mikrodalga fırın kullanılmıştır. Üretilen numuneler üzerinde şu ana kadar olumsuz etkiler gözlenmedi. Bazı yapılar reaksiyon koşullarının optimizasyonu ile ortadan kaldırılamayan küçük bir ikinci bant göstermektedir(Şekil 3A, şerit 4). Genellikle bunlar, iyi optimize edilmiş bir elution gradyanı kullanılırsa ve çıkarılabilirse HPLC kromatogramında bir omuz olarak oldukça net bir şekilde görülebilir (adım 2.2.5). Aşağıdaki tartışma, özellikle konformasyonsal dinamiklerin yorumlanmasına izin veren yüksek kaliteli verilerin elde edilmesiyle ilgili olarak protokoldeki kritik adımları vurgulamayı amaçlamaktadır.
RNase kontaminasyonu Hücre dışı RNas'lar her yerde bulunur, son derece kararlıdır ve NMR örneklerinin uzun vadeli stabilitesi için en büyük tehdidi oluşturur. Bu nedenle, RNase içermeyen bir ortamda çalışmak ve tüm reaktifleri ve plastik yazılım RNase'leri içermeden tutmak çok önemlidir. Filtre uçlarının ve hatta yüz maskelerinin kullanılması önerilir. Bu, HPLC saflaştırmadan sonra özellikle önemlidir. RNases ile kontamine olmuş NMR örnekleri tipik olarak tek nükleotid bozulma ürünleri nedeniyle günler veya haftalar sonra 1H-1D spektrumda görülebilen dar tepeler sergiler. Böyle bir örnek R1φ ölçümleri için uygun değildir.
NMR örneği Yüksek yüklü doğası nedeniyle, RNA çoğu proteine kıyasla yağış olmadan yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir. Shigemi NMR tüplerinin kullanımı (Malzeme Tablosunabakın), yüksek konsantre numunenin bobinin ortalamasına izin verirken, duyarlılıkla eşleşen cam alt ve piston nedeniyle ideal shimming ve kilitleme koşulları sağlarken avantajlıdır. Bu şekilde, B1-inhomogeneity azalır ve daha dar çizgilere yol açtı. Bir NMR tüpündeki tipik numune hacmi 250 μL'dir ve tipik konsantrasyon 1-2 mM'dir. 500 μM'nin altındaki örnekler RD deneyleri için önerilmez, çünkü deney çok uzun sürer ve iyi bir dolgu. Benzer şekilde, 200 μL'nin altındaki numune hacmi önerilmez, çünkü iyi bir dolgu ve alan stabilitesi (kilit) gereklidir. Pistonu takarken, numunede kabarcık oluşumunu önlemek çok önemlidir (adım 2.4.5). Düzgün sabitlenmezse, piston numuneye doğru kayarak algılanabilir birimi azaltabilir. Ayrıca, sıcaklıktaki hızlı değişiklikler numunede yeni kabarcıkların oluşmasına neden olabilir. Bu nedenle, numune taşınırken ve NMR spektrometresunda prob sıcaklığını değiştirirken dikkatli olunmalıdır. Daha uzun bir süre sonra tekrar ölçüm yaparken numunede kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
RNA katlama Dinamik RNA molekülleri düzgün katlandığında birden fazla konformasyonda bulunabilir. İkincil yapıların erime sıcaklıkları oda sıcaklığının sadece biraz üzerinde olsa da, ölçümden önce kapsamlı bir ısıtma ve snap soğutma prosedürü önerilir. Kinetik kontrol (ısıtma ve snap-soğutma) altında katlanan yüksek konsantre saç tokası örnekleri zamanla homodimer oluşturabilir ve bu da her NMR ölçümünden önce RNA katlamanın sıkı kontrolünü gerektirir. Ölçülen RNA bir saç tokası yapısı değil, RNA dubleks ise termodinamik kontrol altında yavaş katlama uygulanmalıdır.
Bu durumda, ısıtmadan sonra soğutma işlemi saat aralığında olmalıdır, RNA ise NMR numunesinde son hacminde ve konsantrasyonunda kullanılır. Beklenen imino ve aromatik rezonansların ilk sayısı, numunenin homojenliği hakkında fikir verebilir. Örnek beklendiği gibi görünmüyorsa, yeniden katlanmalıdır. Mg2+ (klorür tuzu olarak eklenir) katlanır RNA yapıları ile yardımcı olabilir45. Pratikte, katlama kontrolü, en azından NMR rezonanslarını kısmen atamak ve ikincil yapıyı deneysel olarak çözmek için kullanılan bir örnekle karşılaştırma görevi görür.
Dönüş kilidi gücü ve ısıtma konuları 1 H R 1φRD deneylerinin2B genel bakış deneyleri olarak çalıştırılması durumunda, SL gücü 1,2 kHz'den düşük olmamalıdır. Radyofrekans verici frekansı, ilgi çekici zirvelerin ppm bölgesinin ortasına yerleştirilmelidir(örneğin,aromatik protonlar için 7,5 ppm). 1.2 kHz bant genişliği daha sonra bu protonları herhangi bir büyük rezonans etkisi olmadan spin-lock yapacak kadar büyük olacaktır. Bu tür efektler RD profilinde tanımlanabilir. Bunlar oluşursa, özellikledüşük SL gücü için artan SL güç değerleriyle R2+REX değerleri azalmak yerine artar. Hesaplanan SL güç değerlerinin örneğe teslim edilen güce karşılık gelip olmadığını kontrol edin. Pratikte, 1H 90 ° sert darbe daha yeni spektrometrelerde dikkatlice kalibre edilmişse, hesaplanan SL gücü kullanılabilir; ancak, istenen her bant genişliği için SL gücü kalibre edilerek bu kontrol edilebilir.
1 H R 1φRD deneylerinde kullanılabilen SL güç aralığı çok geniştir ve değişen numune ısıtmasına yol açmaktadır (HCP tabanlı diziler için HSQC için 1,2 kHz ila 15 kHz ve SELOPE deneyleri için 50 Hz ila 15 kHz). Eşit olmayan numune ısıtma, düşük güçlü SL'ler için elde edilen 1D'ler karşılaştırıldığındakimyasal kaymada hafif bir değişiklik olarak tespit edilebilir. yüksek güçlü SL'ler. Bu etki genellikle heteronuclei üzerindeki R1φ deneylerinde ısı telafilerinde dikkate alınmaz. Bu deneylerdeki ısı telafisi genellikle her spin kilidi güç serisinin vd listesinde belirtilen farklı dönüş kilidi süreleri nedeniyle farklı ısıtma için düzeltecek şekilde ayarlanır. Özellikle SELOPE deneyi için,20'de açıklandığı gibi tüm uygulanan SL güçlerinde ikinci bir ısı telafisi kullanılmalıdır.
vd listesiyle ilgili önemli noktalar Daha önce de belirtildiği gibi, vd listesi önemli bir yoğunluk bozunması elde etmek için yeterince uzun bir zaman noktası içermelidir (ideal olarak ilk sinyalin% 30'una kadar veya probun özellikleri içinde% 70'lik bir çürümeye ulaşmak mümkün değilse mümkün olduğunca düşük). VD listesi düşük bir SL gücü (1,2 kHz) için optimize edilmiş olsa da, bu vd listesi kullanılacak en yüksek SL gücünde(örneğin,15 kHz) test edilmelidir. Bunun nedeni, önemli REX katkısına sahip zirveler için, çürümenin yüksek SL gücünde çok daha yavaş olacağı gerçeğidir. Bu nedenle, yüksek SL gücünde yeterli bir çürüme de doğrulanmalıdır. Aynı durum, rezonans dışı deneylerde yüksek ofsetlerdeki çürümeler için de düşünülmelidir. VD listesinin ideal maksimum zaman noktası, dağılım deneyinin farklı bölgeleri için önemli ölçüde farklı olabilir. Bu durumda, vd listesine daha fazla nokta eklenebilir ve analiz sırasında daha yüksek SL gücü veya daha yüksek uzaklıklar için daha uzun vD liste noktaları, yol açacakları düşük SINO'ya bağlı olarak atılabilir. Genel olarak, 5-8 vd liste noktalarının J-kaplin gibi üstel olmayan çürümelere yol açan potansiyel eserleri tespit edebileceği düşünülmelidir (aşağıya bakın).
1D-HCP seçicilik konuları HCP tabanlı 1D sürümü çalıştırırken, 2D HSQC tabanlı deneyin 1H boyutunda ilginin zirvesiyle çakışan başka bir tepe varsa, özel dikkat gösterilmelidir. HCP tabanlı transferler çok, ancak asla% 100 seçicidir ve bu nedenle başka bir tepenin 1D'deki ilgi zirvesinin yoğunluğuna ve çürüme davranışına katkıda bulunduğu gerçekleşebilir. Bunun için bir gösterge, etiketli deneyin 1D ve 2D sürümleri kullanılarak elde edilen on-rezonans R 1φ değerlerinde bir fark olacaktır.
ROE ile ilgili önemli noktalar: Yavaş ara değişime sahip atomların rezonans dışı eğrileri için, elde edilen Δω'nin NOESY veya ROESY spektrumu ile karşılaştırılması temel alınarak ROE eserleri tanımlanabilir. Bir çapraz tepe Δω'yekarşılık gelen kimyasal bir kayma farkıyla tanımlanabilirse, gözlemlenen heyecanlı durum aslında bir ROE eseri olabilir(örneğin,ROE'ler aromatik protonlar arasında bulundu, hepsi aynı kimyasal kayma aralığındadır ve bu nedenle rezonans dışı eğriler tarafından kaplanmıştır20). Deneyime göre, bu her zaman büyük hatalarla zayıf uyumlara yol açtı, muhtemelen ROE'nun artan SL gücüyle REX ile aynı deseni takip etmemesi nedeniyle. Orta-hızlı değişim için durum daha da zorlaşır. On-rezonans eğrisi (komşu çekirdek üzerinde elde edilen 13C verisi ile karşılaştırıldığında) hala GS ve ES arasındaki değişim sürecini temsil ederken, rezonans dışı eğri birden fazla ROE eserinden etkilenir.
Bu durumda, değişim işlemini algılamak için SL gücü daha büyüktür (>1,5 kHz) ve bu nedenle, rezonans dışı eğriler çeşitli ROE adaylarının kimyasal kayma farklılıklarına yayıldığı için daha fazla sayıda protona yayılır (H8 için bunlar: ca'daki amino protonlar. ±1000 Hz, H5/H1'ler ca. -1200 Hz, imino protonlar yaklaşık 3500 Hz). Noe/ROE katkısı NOESY spektrası ile hariç tutulamazsa, bu yöntemle gerçek Δω hakkında güvenilir bir bilgi çıkarılamadığından, şimdiye kadar bu ROE eserlerini bastıracak bir yöntem bulunamadı (kısmen kısırlaştırılmış nükleotitler46kullanmak dışında) ve off-rezonans verileri hızlı-ara değişim için kaydedilmemelidir.
J-Kaplin (Hartmann-Hahn) dikkat edilmesi gereken noktalar H6 gibi homonükleer J-bağlantılı protonlar için on-rezonans eğrileri başarıyla kaydedilmiş olsada, 10,20, rezonans dışı ölçümler için özel dikkat gösterilmelidir, özellikle Hartmann-Hahn eşleştirme koşulları araştırılan ofsetlerin geniş bir yelpazesini kapsayabileceğinden düşük SL gücü için. Hartmann-Hahn eserleri, üstel çürüme üzerinde salınımlar veya on-rezonans RD arazilerinde artan SL güçleri ile artanR2+REX değerleri olarak tanımlanabilir20.

RNA'lar hücrede çok sayıda düzenleyici1,katalitik2ve yapısal 3 işlevi gerçekleştirir,bunların çoğu esnek bir moleküler yapı ve bu yapıların karmaşık değişiklikleri ile ilişkilidir4,5,6,7. Düşük nüfuslu durumlar, yapı belirleme yöntemlerinin çoğunda görünmez kalır veya bu gizli durumların yüksek atomik çözünürlükte incelenmesine izin vermez. Çözüm durumu nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, bireysel atom çekirdeklerine erişim sağlayarak ve tüm zaman rejimleri boyunca dinamikleri hedefleyen büyük bir deney araç kutusu sunarak her iki yönü birleştirir8. RD NMR denemeleri, temel eşleştirme desenlerinde ve yerel yapısal yeniden düzenlemelerde değişikliklerin beklenebilir olduğu ara zaman ölçeğinde konformasyonsal değişime erişim sağlar5,9,10,11,12,13,14. RD deneyleri, Carr-Purcell-Meiboom-Gill darbe treni 15 şeklinde uzun R2 ölçümleri veya R1φ RD deneyleri16 olarak adlandırılan dönen çerçevede gevşeme ölçümleri olarakgerçekleştirilir.
Her ikisi de nüfus ve döviz kuru ve kimyasal kayma farkını küçük duruma çıkarmak için kullanılabilse de, R1φ RD deneyleri aynı zamanda heyecanlı devletin kimyasal kayma farkının işaretini verir. Bu, RNA yapılarındaki kimyasal kayma ile güçlü bir şekilde ilişkili olan ikincil yapı üzerinde bir çıkarım sağlar17. Kimyasal kayma, nükleobazlardaki aromatik protonlar ve karbonlar, imino protonlar için baz eşleştirme ortakları ve C4' ve C1' atomları üzerindeki şeker büzücüleri durumunda helicity'nin iyi bir göstergesidir18,19. Son zamanlarda daha yüksek spin kilidi (SL) gücü kullanan bir kimyasal değişim doygunluk transferi (CEST) deneyinin, böylece CEST deneyinin uygulanabilirliğini daha hızlı değişim zaman ölçeklerine kaydırdığı, heyecanlı bir duruma sahip sistemler için R1φ RD deneyine alternatif olarak yayınlandığı belirtilmelidir.
Yapısal değişime erişmek için sıklıkla 13C ve 15N izotopları kullanılmış olsa da, bu laboratuvardan yapılan son çalışmalarda aromatik ve imino protonlar konformasyonsal değişim için prob olarakkullanılmıştır 9,10. Gözlemlenen çekirdek olarak 1H'nin kullanılması, örneğin daha hızlı ve daha yavaş zaman ölçeklerinde değişime erişim, daha yüksek hassasiyet ve daha kısa ölçüm süreleri gibi çeşitli avantajlar getirir. Bu, heteronükleer manyetizasyon transferi yerine homonükleer skaler kavramalar kullanarak tek boyutlu (1D) spektrumun kafeinsizleştirilmesi yoluyla aromatik protonlara erişim sağlayan ve izotop etiketlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak SELective Optimize Edilmiş Proton Deneyi (SELOPE) yaklaşımı ile daha da kolaylaştırılmıştır20. Bu protokol, eşit 13C/15 N etiketli ve etiketsiz numunelerin 1H R1φRD deneylerindeki ölçümü ele alıyor. Bu nedenle, bu makale farklı numune hazırlama ihtiyaçları için en çok yönlü olduğu tespit edilen bir örnek hazırlama yöntemi sunun21 ve bu makalenin son bölümünde alternatifleri ele almaktadır (Şekil 1).
Bu noktada okuyucu, 1 H R 1φRD deneyleri için diğer numune hazırlama tekniklerinin kabul edilebilir olduğunu, sunulan teknikle sentezlenen örneklerle yapısal ve fonksiyonel analizin diğer yöntemlerinin de yapılabileceğini belirtmelidir. 1 H R1φ RD deneyleri, moleküler dinamiklerin güvenilir bir şekilde karakterizeini sağlamak için hem RNA uzunluğunda hem de yapısal konformasyonda yüksek RNA konsantrasyonları (ideal olarak >1 mM) ve yüksek homojenlik gerektirir. In vitro transkripsiyon (IVT), etiketli nükleozid trifosfatların (NTP' ler) ve facile indüksiyonunun enzymatic reaksiyon22'debulunması nedeniyle birçok araştırmacının 13C/15N etiketli RNA örnekleri üretmesi için tercih edilen yöntemdir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan T7 RNA polimeraz (T7RNAP)23,24,25, belirli başlatma dizileri durumunda düşük 5' homojenliktenmuzdariptir 26 , 27 ve genellikle transkripsiyon ikinci tur28sırasında 3' homojenlik . Hedef RNA türlerinin saflaştırılması, büyük miktarlarda ~ 200 nmol ihtiyacı nedeniyle daha pahalı ve zahmetli hale gelir. Burada kullanılan yöntem daha önce avantajların tartışıldığı21. Kısacası, açıklanan sorunları, daha sonra Escherichia coli RNase H tarafından özellikle bölünen, kimerik oligonükleotid29,30 tarafından yönlendirilen daha büyük bir tandem transkript yazarak çözer (ayrıntılar için Bkz. Şekil 2).
Tandem transkriptin 5' ve 3' uçlarında bir aralayıcı dizisinin dahil edilmesi, yüksek verimli bir başlatma dizisinin kullanılmasına ve plazmid şablonunun doğrusallaştırma bölgesine yakın terminal çıkıntilarının kaldırılmasına izin verir (Şekil 2B). Yöntemin, daha karmaşık bir şablon sentezi ve ek bir enzim ve oligonükleotid ihtiyacı ile maliyet ve işçiliği azaltırken, verimi önemli ölçüde artırdığı gösterilmiştir. RNase H bölünmesinin yüksek özgüllüğü, benzer boyut aralığında RNA türlerinin eksikliği nedeniyle arınma sağlar. Mevcut protokol, bu laboratuvar tarafından yakın zamanda yayınlanan bir iyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) adımı kullanır31Diğer yöntemler olası alternatifler olmasına rağmen. 1 H R1φ RD, genel olarak, iki ilgili darbe dizisine sahip etiketli veya etiketsiz örneklerde elde edilebilir, "etiketli" 1H R1φ heteronuclear tek kuantum korelasyonu (HSQC) tabanlı deney ile 13C dolaylı boyut10 ve "etiketsiz" 1H R1φ SELOPE tabanlı deney ile 1H indirekt boyut20.
Bu iki boyutlu (2D) deneyler, R1φ zaman ölçeğindeki dinamiklerin örnekte bulunup bulunmadığına bakılmaksızın ilk denetim görevi görebilirsiniz. Spektrumdaki tüm çözümlenmiş tepeler için RD'ye genel bir bakış elde edilebilir ve daha kapsamlı bir RD analizi için ilgi çekici zirveler belirlenebilir. Bu, etiketlenmemiş numunelerin bile daha pahalı, etiketli bir örnek üretme kararı almadan önce kontrol edilebileceği anlamına gelir. Konformasyonsal değişim katkısına sahip bir zirve daha ayrıntılı bir şekilde çalışılmak üzere seçildikten sonra, yukarıdaki deneylerin 1D sürümlerine geçmek en iyisidir (zirve hala çözülebilirse) sözde rezonans dışı deneyler yapmak için. Etiketli versiyon için, 13C'ye HSQC aktarımı, SELOPE deneyi durumunda,13 C R 1φdeneylerinde 32 , 33 ,34 ,35 'te kullanıldığı gibi seçici bir heteronükleer çapraz polarizasyon(HCP)adımı ile değiştirilir, deney sadece bir 1D olarak çalıştırılır, bu da özellikle 2D'de diyagonal üzerinde yatan H8 ve H2 sinyalleri için yararlıdır. Her ikisinin de etiketli ve etiketsiz bir örneğin mevcut olması koşuluyla, hangi sıranın kullanılacağına ilişkin bir kriter, iki deneyde ilgi zirvesinin ne kadar iyi yalıtılmış olduğudur.
Genel olarak, SELOPE deneyi 50 nükleotide kadar RNA örnekleri için önerilir. Daha büyük RNA'lar için çakışma daha büyük olacaktır; bununla birlikte, yapısal olarak ilginç nükleotitler genellikle daha az üst üste binen ve daha büyük RNA'larda hala erişilebilir olabilen kimyasal kayma bölgelerinde görülür. Başka bir argüman, etiketlenmemiş örneklerde, 1H ile 12C arasında J bağlantısı oluşmadığıdır. Bununla birlikte, minimum döndürme kilidi gücü, etiketli deneyde bu iki dönüşü (~1 kHz) ayırmak için kullanılan minimum güçle tanımlandığı için, etiketlenmemiş deneme, daha geniş bir spin kilidi (SL) güçlü yönlerinin kullanılmasına ve bu nedenle daha geniş bir değişim zaman ölçeğine erişime izin verir. Bu rezonans dışı deneyler, heyecanlı devletin popülasyonu (alternatif konformör), p ES gibi kex'eek bilgiler veΔω (zemin durumunun kimyasal kayma farkı ve heyecanlı durum) şeklinde çok değerli kimyasal kayma bilgileri sağlar. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> Şekil 1: Sunulan protokolün iş akışı. Şablon hazırlama ve başarılı in vitro transkripsiyon ve RNase H dekolte teyidsinden oluşan gerçek büyük ölçekli numune üretiminden önce hazırlık. HPLC saflaştırma, NMR tüpünün doldurulması ve RNA katlama onayı dahil olmak üzere büyük ölçekli üretim. Izotop etiketli sentez durumunda, aynı gün gradyan optimizasyonu için etiketsiz bir saflaştırma yapılmalıdır. R1φ deneyleri ile konformasyonsal dinamiklerin NMR karakterizasyonu. Her adım bağımsız olarak gerçekleştirilebilir, örneğin 1H R1φ RD analizi başka bir yöntemle üretilen herhangi bir uygun RNA örneğine uygulanabilir. Kısaltmalar: IVT = in vitro transkripsiyon; HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; NMR = nükleer manyetik rezonans; RD = gevşeme dağılımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolün amacı, RNA saç tokası moleküllerinde 1 H R 1φ gevşeme dağılımı ile konformasyonsal dinamiklerin incelenmesi için pratik ayrıntılar ve kritik parametreler sağlamaktır. 13C/15N etiketli sürümler olarak tüm, bazıları veya hiçbiri NTP'leri kullanılarak gerçekleştirilebilen bir hedef RNA'nın tasarımı, sentezi ve iyon değişimi HPLC saflaştırmasının ayrıntılı bir protokolünü sağladıktan sonra, NMR örneğini sonlandırma ve NMR spektroskopisi ile konformasyonel değişimi onaylama iş akışı açıklanmıştır. Son olarak, Bruker NMR spektrometresi üzerinde 1H R1φ RD deneylerinin kurulumu için ayrıntılar açıklanmıştır (Şekil 1). Protokol, etiketli örnekler ve ek yorumlar için 1D sürümü ayarlamak için her adımı ve SELOPE sürümünün(Tablo 2)kurulumu için ayarlamak üzere bir tablo verir. Protokolden sonra, kritik adımlar ve örnek hazırlama ve 1 H R 1φRD kurulumu için alternatif yollar tartışılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>&#160;161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFC-3000, HPLC Fraction collector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5702.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ImageQuant 800 UV</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29399482</td>
			<td>Replacing LAS-4000 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>514-1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>1081220005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleavage guide</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC system&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAPac PA200 22x50 guard column&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SP6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli RNase H</td>
			<td>&#160;NEB</td>
			<td>&#160;M0297L</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7Y4&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>&#160;Fisher scientific</td>
			<td>11574139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95% denatured</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>85829.29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelRed</td>
			<td>&#160;VWR</td>
			<td>41003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kbp Plus</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;SM1333</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>650684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic pyrophosphatase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;I1643-100UN</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P0A7A9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Julabo TW8 Water bath&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>461-3117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-0056</td>
			<td>or comparable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth with agar (Lennox)</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Range ssRNA Ladder&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>&#160;N0364S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPG-3400RS Pump&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5040.0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>63068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microRNA Marker&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N2102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>&#160;Samsung</td>
			<td>&#160;MS23F301EAW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN electrophoresis equipment</td>
			<td>&#160;Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>&#160;Machinery-Nagel</td>
			<td>&#160;740414.10M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19 plasmid containing tandem insert</td>
			<td>&#160;Genscript</td>
			<td>&#160;N/A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shigemi tube 5mm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z529427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use syringe, Luer lock tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-2008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;730-1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium perchlorate</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>71853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine trihydrochloride</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>85578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>514-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>10881767001</td>
			<td>&#160;or made in-house uniprot ref. P00573</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCC-3000RS Column thermostat&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>10103203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP-13C9/15N2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>651370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP-13C10/15N5</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>645672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWD-3100 Detector&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5074.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical aspects of sample preparation and setup of 1h r1&#961; relaxation dispersion experiments of rna

RNA, yapılardaki değişikliklerin RNA moleküllerinin hücresel haberciler ve modülatörler olarak yürüttüğü işlevlerde önemli roller oynadığı son derece esnek bir biyomoleküldür. Bu dinamik durumlar çoğu yapısal yönteme gizli kalırken, R1φ gevşeme dağılımı (RD) spektroskopisi, mikro-milisaniye rejimindeki konformasyonsal dinamiklerin atomik çözünürlükte incelenmesini sağlar. Gözlemlenen çekirdek olarak 1H'nin kullanılması, kapsanan zaman rejimini daha da genişletir ve hidrojen bağlarına ve baz eşleştirmesine doğrudan erişim sağlar.
Böyle bir çalışmadaki zorlu adımlar, potansiyel olarak 13 C ve 15 Netiketli yüksek saflık ve yüksek verimli numune hazırlamanın yanı sıra, daha önce görünmeyen devletin popülasyonunu, döviz kurunu ve ikincil yapısını çıkarmak için deneylerin kurulumu ve verilerin takılmasıdır. Bu protokol, uygun bir RNA örneğinin hazırlanmasını ve hem izotopik olarak etiketlenmiş hem de etiketlenmemiş RNA örnekleriyle 1H R1φ deneyinin kurulumunu sağlamak için numune hazırlamada çok önemli uygulamalı adımlar sağlar.

RNA üretimi protokolü, yüksek saflıkta transkriptlerin üretilmesi yoluyla saflaştırmayı kolaylaştırır. Şekil 3A, tandem transkriptlerin birkaç bölünme reaksiyonunun sonuçlarını gösterir ve hem başarılı hem de başarısız reaksiyonlar sağlar. Lane 1, yan ürünlerin sadece silik izlerine sahip tamamen bölünmüş bir transkriptin en uygun kasasını gösterir. Lane 2a, yeniden tavlama ve daha fazla RNase H eklenmesiyle çözülebilen eksik bölünme gösterir (Lane 2b, adım 2.1.2). 1, 2a ve 2b şeritlerinin RNA yapıları aynıdır. Şerit 3'teki örnek başarısız dekolte gösteriyor. Bu reaksiyonun giderilmesi, bölünme kılavuzu dizisinin, DNA şablonunun saflığının ve tavlama sıcaklıklarının kontrolunu içerir. Potansiyel olarak, RNase H dekoltesi, örnek 2 için gösterildiği gibi T7 IVT'den sonra yapılmalıdır.
Şerit 4'teki örnek, iyon değişimi HPLC ile çıkarılması zor olan önemli miktarda bölünme yan ürünü gösterir. Böyle bir numunenin sorunlarının giderilmesi, (a) sıcaklığın, RNase H miktarının veya reaksiyon süresinin azaltılmasını, (b) elution gradyan ve enjeksiyon hacminin azaltılmasını ve hedef kesirlerin yan ürünlerden ayrılmasına çalışılmasını içerebilir. İyon değişiminde çözünürlüğün nasıl artırılacağı hakkında daha fazla bilgi HPLC saflaştırma Karlsson ve ark.31. HPLC, hedef RNA'yı daha uzun veya daha kısa nükleik asitlerden ve protein veya küçük moleküllü kirleticilerden ayırır. Şekil 3B, iyon değişimi HPLC saflaştırması için en uygun sonucu göstermektedir. Elution gradyanı, hedef RNA türünün bir sonraki küçük türden sonra en az bir sütun hacmini (bu örnekte: 35 mL) ve bir sonraki büyük türden önce bir sütun hacmini atlatacak şekilde seçilmelidir.
Bu yöntemdeki daha küçük türler arasında tek nükleotitler, iptal edici ürünler (8-12 nt), 3' ve 5' ara sıraları (5-14 nt) ve bölünme kılavuzu (12 nt kimerik nükleik asit) bulunurken, daha uzun diziler potansiyel olarak temizlanmamış tandem tekrarları ve plazmiddir. İyi ayrılmış bir elution zirvesi elde edildiğinde, saflaştırma enjeksiyon başına ~20 mL IVT reaksiyonuna eşdeğer olacak şekilde ölçeklendirilebilir. Bir RNA örneğinin doğru katlanmış olması RD deneyleri için çok önemlidir ve her ölçümden önce onaylanması gerekir. Şekil 4, 2.4 (mavi) adımdaki katlama protokolü uygulanmadan önce A etiketli 22 mer RNA'yı ve doğru katlama elde edildikten sonra aynı örneği göstermektedir (kırmızı). Bir Mc-Fold ikincil yapı tahmini (Şekil 4C) sunulan saç tokası yapısını 4 baz çifti ile 5 imino sinyalle sonuçlanır.
Şekil 4A'daki her iki spektrum da, biraz farklı göreceli yoğunluklarda da olsa, bu tahmin edilen sinyalleri doğrular, bu da bazı yanlış katlanmış yapının (burada, bir dimer) sadece 1 H 1Dspektrumla değerlendirilmesinde sorunlu olabileceğini gösterir. Aromatik 1H,13C-HSQC spektrumu (Şekil 4B), ancak katlama protokolünden (mavi) önce numune için aromatik sinyallerin sadece 3'ünü gösterir, ancak 2.4 adımına (kırmızı) göre katlanmış numune için 4 sinyalin tümünü gösterir. Mavi renkte gösterilen örnek muhtemelen saç tokası ile aynı imino sinyallerle sonuç olacak bir homodimer (Şekil 4D'deönerilen yapı) oluşturmuştur. A13H2 sinyali değişim açısından genişlemiş görünüyor. Bu sonuçlar, her RD deneyinden önce hem imino hem de aromatik parmak izi deneyleri ile katlama onayının önemini vurgulamaya yardımcı olur. Bu protokolde açıklanan 1H R1φ darbe dizileri, ara değişim rejimindeki dinamiklerin algılanmasını sağlar. Başlangıçta bir on-rezonans eğrisi kaydedilir ve belirli bir kalıntı için dinamikler varsa, elde edilen R2+REX değerleri içinde bir dağılım görünürken, bu eğri değişimsiz kalıntılar için düzdür.
Şekil 5, sentetik bir RNA saç tokasında iki farklı H8 atomunda elde edilen temsili rezonans eğrilerini gösterir (Şekil 5A), burada G6H8 değişim yaşar (Şekil 5C), A4H8 ise (Şekil 5B). Değişim bu örnekte nispeten yavaş olduğundan(kEX = 292 ± 40 Hz), SELOPE deneyinin düşük SL güçlü yanlarına ulaşma avantajından yararlanıldı ve iki rezonans eğrisi darbe dizisinin 1D sürümü kullanılarak kaydedildi. Aynı darbe dizisi daha sonra on-rezonans profilinde dağılım gösteren kalıntı için rezonans dışı veri elde etmek için kullanıldı. Şekil 5D, elde edilen R1φ değerlerini ve eğrinin hafif bir asimetrisinin zaten Δωişaretini gösterdiği ofseti gösterir.
Bu, R1 katkısının kaldırıldığı R2+REX arsasında daha da belirgin hale gelir ( Şekil5E). Aynı şeklin sağ sütunu, iki farklı H8 atom için elde edilen temsili on-rezonans eğrilerini daha hızlı değişime sahip biraz farklı sentetik RNA saç tokasında gösterir, burada G6H8 değişim yaşar (Şekil 5G), A4H8 ise (Şekil 5F). Daha hızlı döviz kuru(kEX = 43.502 ± 38.478 Hz), hem açık hem de rezonans dışı verileri (Şekil 5H,I'degörüntülenen G6H8 verileri) elde etmek için SELOPE 2D sürümünü kullanarak tüm aromatik protonların rd kaydına izin verdi.
Olumlu ve olumsuz sonuçlar için genel tanımlayıcılar Tandem IVT ve RNase H dekoltesinde olumlu sonuçlar şu şekilde tanımlanabilir: 1) Hedef bant denatüre PAGE jeldeki en güçlü banttır. 2) Ana bandın etrafında zayıf bantlar yoktur veya sadece zayıf bantlar yoktur. 3) Daha yüksek moleküler ağırlıklı türler yoktur veya sadece zayıftır. 4) HPLC kromatogramı, hedef RNA'nın iyi ayrılmış bir zirvesini gösterir. 5) Ana tepe örneklendiğinde, denatüre page jel üzerinde sadece bir bant görünür.
Tandem IVT ve RNase H dekoltesinde negatif sonuçlar şu şekilde mevcuttur: 1) Denatüre page jel üzerinde hayır veya sadece zayıf bir ana bant görülebilir. 2) RNA tandem tekrarlarından yüksek moleküler ağırlıklı türlerin bir deseni görülebilir. 3) Ana bant mevcut olmasına rağmen, benzer yoğunlukta bantlar ± 3 nt içindeki ana bandın üstünde veya altındadır.
İyi katlanmış bir örnek aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) Gözlemlenen imino protonların sayısı, ikincil bir yapı simülasyonundan beklenen imino proton sayısıyla eşleşir (örneğin,Mc-Fold39, Şekil 4A). 2) Bir UUCG döngüsündeki (varsa) syn G-U sallantı taban çifti ~ 9,5 ppm'de görülebilir, bazen sadece daha düşük sıcaklıkta görülebilir. UUCG döngüsünün daha fazla parmak izi Fürtig ve meslektaşları tarafından tanımlanmıştır40. 3) Aromatik parmak izi, doğru katlandığında onaylanmış daha önce atanmış bir örnekle aynı fikirdedir (Şekil 4C).
Yanlış katlanmış veya bozulmuş bir örnek aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) İkincil bir yapı simülasyonunun öngördüğünden daha fazla imino sinyali vardır (NOT: daha az imino sinyali, kapanış taban çiftleri genellikle görünmediği ve konformasyonsal değişim çizgileri genişletdiği için mutlaka yanlış katlanma anlamına gelmez). 2) İmino sinyallerinin yokluğu. 3) Aromatik bölgede tek nükleotid bozunma ürünlerini gösteren yüksek yoğunluklu dar sinyaller. 4) Onaylanmış katlama referans örneğine imino veya aromatik sinyaller arasında ayrışma (Şekil 4C).
Algılanabilir zaman ölçeğinde değişim göstermeyen bir atom aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) düz bir RD profilinden (uygulanan SL gücüne göre değişen eksik REX katkısı nedeniyle) (Şekil 5B ve Şekil 5F). 2) kEX ve Δω aynı büyüklükteki olduğunda yavaş ara değişim durumunda dikkatli olunmalıdır. Bu durumda, on-rezonans katkısı Şekil 5C'de görülebileceği gibi çok küçük olabilir (bu durumda takılan parametreler kEX = 292 ± 40 Hz ve Δω = 112 ± 4 Hz'dir). Şüpheniz varsa, doğrulama için düşük bir SL rezonans eğrisi kaydedilebilir.
Ara zaman ölçeğinde değişimi gösteren bir atom, 1) on-rezonans RD deneyinde düz olmayan bir gevşeme dağılımı profilinden tanımlanabilir (Şekil 5B ve Şekil 5F); 2) HSQC veya SELOPE deneyinde daha geniş bir çizgi genişliği de değişim için bir gösterge olabilir.
Rezonans dışı eğriler için iyi seçilmiş SL güç değerleri (Şekil 5E, F): 1) on-rezonans eğrisinde önemli bir k EX katkısına sahiptir (seçilen SL güç değerleri Şekil 5C ve Şekil 5G'debelirtilmiştir). 2) En az 3 SL güç değeri için rezonans dışı eğriler ölçüldüğünden, seçilen SL güç değerleri kEX katkı ile on-rezonans eğrisinin bölgesine yayılmalıdır. 3) Laguerre sığdıktan sonra düz olmayan R2+REX eğrilerine yol açar (örneğin, Şekil 5D: SL mukavemetleri 25, 50 ve 75 Hz; Şekil 5E).
Rezonans dışı eğriler için kötü seçilmiş SL güç değerleri (Şekil 5E, F) Laguerre sığdıktan sonra düz R2+REX eğrilerine yol açar. Bir örnek gösterilmiştir Şekil 5E, burada 100 Hz rezonans eğrisi çok düzdür ve bu nedenle Δωhakkında önemli bilgi sağlamaz.
Dönen çerçeveli nükleer Overhauser etkisi (ROE) eserleri için endikasyonlar: 1) Rezonans eğrilerinden elde edilen Δω, nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrumundaki ilginin zirvesi ile çapraz bir tepe gösteren uzaysal çevre / protonlardaki protonların kimyasal kaymalarıyla eşleşir. (örneğin, Şekil 5I, hızlı ara değişim için beklendiği gibi geniş rezonans dışı eğriler gösterir, ancak eğriler -3000 Hz ve +1500 Hz'de daha keskin özelliklere de sahiptir. Bunlar büyük olasılıkla farklı bir konformörde bu H8 için kimyasal bir kayma yerine bir ROE eserinden kaynaklanmaktadır). 2) Laguerre fit işe yarar, ancak yüksek SINO (>20)(örneğin, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) ile yapılan deneylerden üsteller elde edilmiş olsa da, bir on-rezonans ve en az 3 rezonans eğrisi için iyi çalışmaz (yüksek hatalar veya fiziksel olarak imkansız değerler verir). Genellikle her SL ayrı ayrı iyi uyar, ancak bunları birbirine uydurmak çok daha yüksek bir hata verir; gerçek bir heyecanlı durum için tam tersi bir davranış beklenir.
"Gerçek" değişim endikasyonları Δω: 1) Rezonans dışı eğrilerden elde edilen Δω, NOESY spektrumunda ilginin zirvesi ile çapraz bir zirve gösteren uzaysal çevre / protonlardaki protonların kimyasal kaymalarıyla eşleşmez (örneğin, Şekil 5E). 2) Laguerre fit, on-rezonans için düşük hatalar ve en az 3 rezonans dışı eğri verir(örneğin, Şekil 5E vs. Şekil 5I, uygun sonuçlar için resim yazısına bakın).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig3v5.jpg"> Şekil 3: T7 tandem IVT ve RNase H dekolte reaksiyonunun örnek üretimi. (A) Tandem IVT ve RNase H dekoltesinin olumlu ve olumsuz sonuçlarının denatüre SAYFASI. Merdiven yüksekliği RNA referanslarını, 12* ise kimerik dekolte kılavuzunu ifade eder. Şerit 1: 20 nt hedef RNA'nın başarılı üretimi. Birkaç kısa ve uzun ürün mevcuttur. Şerit 2a: Tandem transkriptinin eksik bölünmesi. HPLC saflaştırması mümkün olsa da, çok fazla malzeme boşa harcanır. Lane 2b: Lane 2'nin devam eden RNase H bölünmesi, HPLC enjeksiyonuna hazır temiz bir örnek üretir (Lane 1 ile aynıdır). Lane 4: RNase H dekoltesi büyük ölçüde başarısız oldu ve hedef bant üretilmedi. Tam uzunlukta tandem transkript hala 600 nt'de görülebilir. Lane 5: Bir hedef bant üretildi, ancak güçlü bir -1 bandı mevcut. HPLC yapılabilmesine rağmen, yan ürünün dikkatli bir şekilde çıkarılması gerekir. (B) Başarılı bir HPLC enjeksiyonu örneği. 38 dakikadaki zirve, hedef uzunlukta saf RNA içerirken, daha uzun ve daha kısa ürünler hedef RNA'dan iyi ayrılır. Panel B 21'den değiştirildi. Kısaltmalar: IVT = in vitro transkripsiyon; HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; nt = nükleotitler; AU = rasgele birimler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2.jpg"> Şekil 4: A etiketli22-mer RNA'nın 1 H-1D spektrumunun NMR. (A ) Imino bölgesindeki katlama adımı 2.4 (bkz. protokol) öncesi (mavi) ve sonra (kırmızı) RNA saç tokası örneği. imino sinyallerinin baz çifti kimliği için beklenen bölgeler aşağıda gri ile belirtilmiştir. (B) 1H,13C-HSQC spektrumu RNA'nın aromatik rezonanslarının panel A'dan. Katlamadan sonraki örnek (kırmızı) beklendiği gibi 4 sinyal gösterirken, katlamadan önceki örnek (mavi) yalnızca 3 sinyal gösterir. (C) 22-mer RNA'nın saç tokası olarak Mc-Fold tahmini. Panel A. (D) 22 mer RNA tarafından oluşturulan bir homodimerin önerilen yapısında her iki örnekte de bulunabilen bu ikincil yapıdan beş imino sinyali beklenebilir ve bu da saç tokası yapısıyla aynı 5 baz çifti ile sonuçlanır. Kısaltmalar: NMR = nükleer manyetik rezonans; 1D = tek boyutlu; HSQC = heteronükleer tek kuantum korelasyonu; ppm = milyon başına parça. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2.jpg"> Şekil 5: RNA saç tokası bazlı iki farklı yapı için 1H R 1φ RD temsili sonuçları. (A) Sol sütun, şişkin U'nun üzerinde bir C-G taban çifti ile RNA'da elde edilen sonuçları gösterirken, sağ sütun, taban çiftinin yerine G-C'ye geçirildiği bir örnekte elde edilen sonuçları gösterir. (B) ve (F) iki yapı için A4H8 için elde edilen düz dispersiyon profillerini gösterir ve konformasyonsal değişim olmadığını gösterir. (C–E) (G-C) yapısında G6 için elde edilen on-rezonans, off-rezonans ve takılı verileri gösterir. Laguerre uyumu aşağıdaki sonuca yol açar: R1 = 2.87 ± 0.01 Hz, R2 = 7.76 ± 0.03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± %0,03, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) (G-C) yapısında G6 için elde edilen on-rezonans, off-rezonans ve takılı verileri gösterir. Laguerre uyumu aşağıdaki sonuca yol açar: R1 = 1.93 ± 0.02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p ES = 27 ± %16, Δω = 203 ± 166 Hz. Bu rakam 20'den değiştirildi. Kısaltma: SL = spin lock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1Ï Relaxation Dispersion Experiments of RNA at JoVE.com

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

13 C/ 15 Netiketli ve etiketsiz RNA'da mikro-milisaniye dinamikleri1H R1φ gevşeme dağılımı nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokolün odak noktası, NMR deneylerinin yüksek saflıkta numune hazırlanması ve kurulumunda yatmaktadır.

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Bu protokol, RNA moleküllerindeki onay değişimini incelemek için proton R1rho gevşeme dispersiyon ölçümleri için RNA numune hazırlama ve NMR kurulumunu açıklar. Protonlar yok edildiğinden, yöntem izotopik etiketlemeye ihtiyaç duymaz ve kaydırılmış baz eşleştirme gibi yapısal özelliklere doğrudan erişebilir. Pipet, numune farklı bir yöntemle üretilse bile R1rho gevşeme dağılımının ölçülebilmesi anlamında oldukça modülerdir.Plazmid örneğini hazırlayarak ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bir in vitro transkripsiyon ve bölünme reaksiyonunu kurarak başlayın. Reaksiyonun 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatması. Daha sonra yükleme çözeltisinde numunenin bir mikroliterini on kat seyreltin.Ve bir denatüre PAGE jel üzerinde bir mikroliter çalıştırın. Bölünme reaksiyonı başarılı olursa, reaksiyonun istenen hacme ölçeklen ve gece boyunca çalıştırın. Ardından başka bir denatüre PAGE jeli çalıştırın ve bölünme reaksiyonu tamamlanıp tamamlanmadığını değerlendirin.Eksik bölünme durumunda, reaksiyon çözeltisini geleneksel bir mikrodalga fırında 15 saniye boyunca 450 watt'ta ısıtın. Ardından RNA'yı ve dekolte kılavuzunu yeniden elde etmek için çözeltiyi 40 dakika boyunca yavaşça 37 santigrat dereceye soğutun. Ve yeni bir çökelticinin oluşumuna dikkat edin.Daha fazla inorganik pirofosfataz ekleyin ve RNase H.Inubate reaksiyonu 37 santigrat derecede bir ila üç saat boyunca inkübatör. Ardından dekolte reaksiyonunun tamamlandığını denatüre PAGE ile onaylayın. RNase H bölünme reaksiyonu tamamlandığında, 50 milimoler son konsantrasyona EDTA ekleyerek reaksiyonu söndürün.Ve iyice girdap. Çözeltiyi 0,2 mikron şırınga filtresinden geçirin. Ve çözümü, saflaştırma için bir HPLC sistemine enjekte edilebilen bir hacme konsantre edin.Konsantre ve arıtılmış numuneyi NMR tüpüne eklemeden önce bol su ile temizleyerek tüpü temizleyin. Sonra RNase dekontaminasyon reaktifi, su ve% 95 etanol. Son durulamadan sonra suyla kurumaya bırakın.Pistonu suyla durulayın ve RNase dekontaminasyon reaktifi ve% 95 etanol ile temizlemek için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Tüpü ve pistonu kuruttuktan sonra NMR örneğine %10 D2O ekleyin. RNA örneğini NMR tüpüne aktarmak için büyük bir pipet ucu kullanın ve tüp duvarının yan tarafı boyunca akıtın.Pistonu, hava kabarcıklarını gidermek için hızlı bir büküm hareketiyle aşağı iterek tüpe yerleştirin, ardından yeni hava kabarcıkları oluşturmadan pistonu yavaşça yukarı çekin. Ve parafin balmumu filmiyle tamir et. RNA ataması için tam etiketli RNA örneklerinde kullanılan aromatik proton karbon HSQC veri kümesini temel alan yeni bir veri kümesi oluşturun.Genel parametreleri ve RD'ye özgü parametreleri ayarlayın. Ardından proton spin kilit gücünü test için 1,2 kilohertz olarak ayarlayın. Yalnızca bir giriş, sıfır milisaniye, TDF1'i bir olarak ayarlayın ve D30'u bir test spektrumu çalıştıracak şekilde güncelleştirin.Test vd listesi ayarladıktan sonra D30 ve TDF1'i güncelleştirin. Ve farklı dönüş kilidi uzunlukları için tepenin yoğunluğunu çizin. Orijinal tepenin yoğunluğunun üçte birine düştüğü dönüş kilidi uzunluğunu tanımlayın.Test çalıştırmalarının sonucundan, denemede kullanılacak son vd listesini oluşturun. Listenin en zayıf zirvesinin en az 10 sinyal -gürültü oranına sahip olması için tarama sayısını seçin. Tandem transkriptlerin birkaç dekolte reaksiyonunun sonuçları burada gösterilmiştir.Başarılı bir reaksiyonla 20 nükleotid hedef RNA üretildi. Başarısız reaksiyonlar, numunenin eksik ve başarısız bölünmesine neden oldu. RNA örneğinin HPLC enjeksiyonu, 38 dakikada saf hedef RNA için bir zirve olduğunu ortaya çıkardı.Daha uzun ve kısa ürünler ilginin zirvesinden iyi ayrılmışken. RNA saç tokasının analizi, gözlemlenen imino protonların sayısının ikincil bir yapı simülasyonundan beklenen imino proton sayısıyla eşleştiğini gösterdi. RNA'nın aromatik rezonanslarının proton karbon HSQC spektrumu katlandıktan sonra dört sinyal gösterdi.Ve katlamadan önce sadece üç sinyal. İki farklı H8 atom ve iki farklı sentetik RNA saç tokası için elde edilen rezonans eğrileri temsilcisinde, G6H8 onay değişimi yaşar. A4H8 olmasa da.G6H8 için renkli döndürme kilidi güçleri seçildi ve rezonans dışı veriler kaydedildi. Değişimin yavaş olduğu CG yapısında, R1rho satır değerlerine karşı ofset grafiği zaten eğrinin hafif bir asimetrisini görüntüledi ve kimyasal kayma farkı delta omega'nın işaretini gösterdi. Bu, R1 katkısının kaldırıldığı R2 artı REX grafiğinde daha da belirgin hale gelir.Öte yandan, GC yapısı daha hızlı değişim yaşar ve R1rho değerlerine karşı ofset arsa, delta omega'nın ekstraksiyonunun R2 artı REX grafiğinde bile daha az belirgin hale geldiği daha geniş bir eğri sundu. RNA dinamikleri aydınlatıldıktan sonra, durumlar karakterize edilebilir ve tuzağa düşürülebilir. Bu kapana kısılmış durumlar, örneğin biyolojik tahlillerde test edilebilir.Bu yöntem, aktif bir mikroRNA miRNA kompleksinde fonksiyonel, ilgili baz eşleştirme kaymalarını, ribozomal RNA'da döngü yeniden düzenlemelerini ve tek nükleotid çıkıntılarında baz çifti stabilitesini gözlemlememizi sağlar.