Isolering af Mouse Megakaryocyte Forfædre

Knoglemarvs megakaryocytter er store polyploidceller, der sikrer produktionen af blodplader. De stammer fra hæmatopoietiske stamceller gennem megakaryopoiesis. De sidste faser af denne proces er komplekse og involverer klassisk de bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) og unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). Disse populationer går forud for dannelsen af bona fide megakaryocytter, og som sådan kunne deres isolation og karakterisering give mulighed for en robust og upartisk analyse af megakaryocytdannelse. Denne protokol præsenterer i detaljer proceduren for indsamling af hæmatoopoietiske celler fra musebenmarv, berigelse af hæmatoopoietiske forfædre gennem magnetisk udtømning og endelig en cellesorteringsstrategi, der giver stærkt rensede MEP- og MKp-populationer. For det første opsamles knoglemarvsceller fra lårbenet, skinnebenet, og også iliaca crest, en knogle, der indeholder et stort antal hæmatopoietic forfædre. Brugen af iliac crest knogler drastisk øger det samlede celletal opnået pr mus og dermed bidrager til en mere etisk brug af dyr. En magnetisk afstamning udtømning blev optimeret ved hjælp af 450 nm magnetiske perler giver en meget effektiv celle sortering af flow cytometri. Endelig præsenterer protokollen mærknings- og gatingstrategien for sortering af de to stærkt rensede megakarycyt stamfaderpopulationer: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) og MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Denne teknik er let at gennemføre og giver nok cellulært materiale til at udføre i) molekylær karakterisering for en dybere viden om deres identitet og biologi, ii) in vitro differentiering assays, der vil give en bedre forståelse af mekanismerne for modning af megakaryocytter, eller iii) in vitro modeller af interaktion med deres mikromiljø.