Dinamica di formazione dei proplatelet degli espianti di midollo osseo fresco del topo

L'ultimo stadio della megacariopoiesi porta a estensioni citoplasmatiche da megacariociti maturi, i cosiddetti proplatelets. Molto è stato appreso sulla formazione di proplatelet utilizzando megacariociti differenziati in vitro; tuttavia, vi è una crescente evidenza che i sistemi di coltura convenzionali non ricapitolano fedelmente il processo di differenziazione / maturazione che avviene all'interno del midollo osseo. In questo manoscritto, presentiamo un metodo di espianto inizialmente descritto nel 1956 da Thiéry e Bessis per visualizzare i megacariociti che sono maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così potenziali artefatti e interpretazioni errate. I midollo osseo fresco vengono raccolti lavando i femori dei topi, tagliati in sezioni trasversali di 0,5 mm e posti in una camera di incubazione a 37 °C contenente un tampone fisiologico. I megacariociti diventano gradualmente visibili alla periferia dell'espianto e vengono osservati fino a 6 ore sotto un microscopio invertito accoppiato a una videocamera. Nel corso del tempo, i megacariociti cambiano forma, con alcune cellule che hanno una forma sferica e altre che sviluppano estensioni spesse o estendono molte proplatelet sottili con un'ampia ramificazione. Vengono effettuate indagini sia qualitative che quantitative. Questo metodo ha il vantaggio di essere semplice, riproducibile e veloce in quanto sono presenti numerosi megacariociti, e classicamente la metà di essi forma proplatelet in 6 ore rispetto ai 4 giorni per i megacariociti di topo in coltura. Oltre allo studio dei topi mutanti, un'applicazione interessante di questo metodo è la semplice valutazione degli agenti farmacologici sul processo di estensione del proplatelet, senza interferire con il processo di differenziazione che può verificarsi nelle colture.