Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen

Steriel α-motief/histidine-aspartaat domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) remt de replicatie van HIV-1 in rustige myeloïde cellen. U937-cellen worden veel gebruikt als een handig celsysteem voor het analyseren van SAMHD1-activiteit vanwege een laag niveau van SAMHD1-RNA-expressie, wat leidt tot niet-detecteerbare endogene eiwitexpressie. Op basis van vergelijkbare assays ontwikkeld in het Stoye-laboratorium om andere retrovirale restrictiefactoren te karakteriseren, ontwikkelde het Bishop-lab een tweekleurige restrictietest om SAMHD1 in U937-cellen te analyseren. Murine Leukemie Virus-achtige deeltjes die SAMHD1 tot expressie brengen, naast YFP uitgedrukt uit een IRES, worden gebruikt om U937-cellen te transduceren. Cellen worden vervolgens behandeld met phorbol myristate acetaat om differentiatie tot een rustig fenotype te induceren. Na differentiatie worden cellen geïnfecteerd met HIV-1-virusachtige deeltjes die een fluorescerende verslaggever tot expressie brengen. Na 48 uur worden cellen geoogst en geanalyseerd door flowcytometrie. Het aandeel hiv-geïnfecteerde cellen in de SAMHD1-tot expressie brengende populatie wordt vergeleken met dat in interne controlecellen zonder SAMHD1. Deze vergelijking laat een beperkingsverhouding zien. SAMHD1-expressie leidt tot een vijfvoudige vermindering van hiv-infectie, wat overeenkomt met een beperkingsverhouding van 0,2. Onze recente vervanging van RFP door de oorspronkelijke GFP als het reporter-gen voor HIV-infectie heeft flowcytometrie-analyse vergemakkelijkt.

Deze test is met succes gebruikt om het effect van aminozuursubstituties op SAMHD1-beperking te karakteriseren door te transduceren met virussen die coderen voor veranderde SAMHD1-eiwitten, afgeleid van site-gerichte mutagenese van de expressievector. De katalytische sitesubstituties HD206-7AA vertonen bijvoorbeeld een restrictiefenotype van 1, wat wijst op een verlies van restrictieactiviteit. Ook kan de gevoeligheid van verschillende testervirussen worden bepaald. De test kan verder worden aangepast om het effect van differentiatiestatus, metabole status en SAMHD1-modifiers op te nemen om de relatie tussen SAMHD1, celmetabooltoestand en virale beperking beter te begrijpen.