이 연구는 Cancer Research UK (FC001042 및 FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 및 FC001162) 및 Wellcome trust (FC001042 및 FC001162)와 JPS (108012 / Z / 15 / Z)에 대한 Wellcome Trust Investigator Award의 핵심 자금을받는 Francis Crick Institute의 지원을 받았습니다. 케임브리지 대학교에서의 작업은 NIHR 캠브리지 생물 의학 연구 센터, 에블린 트러스트 (16/21), 로즈 트리 트러스트 (M590) 및 영국 의학 연구위원회 (MR / S009752 / 1)가 공동 자금을 지원했습니다. 후자의 영국 자금 지원 상은 유럽 연합이 지원하는 EDCTP2 프로그램의 일부입니다.

<ol>
	<li>Sundstr&#246;m, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+(U-937).">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li><li>Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+transient+assay+for+studying+the+genetic+determinants+of+Fv1+restriction.">Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction.</a> Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).</li><li>Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAMHD1+has+differential+impact+on+the+efficacies+of+HIV+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors.">SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).</li><li>Amie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-HIV+host+factor+SAMHD1+regulates+viral+sensitivity+to+nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors+via+modulation+of+cellular+deoxyribonucleoside+triphosphate+(dNTP)+levels.">Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).</li><li>Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+enzyme-coupled+assay+for+triphosphohydrolase+activity+of+HIV-1+restriction+factor+SAMHD1.">A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).</li></ol>

오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출로 인해 발생하는 모든 저자 승인 원고 버전에 CC BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다. 표현된 견해는 저자(들)의 견해이며 반드시 NIHR 또는 보건 사회 복지부의 견해는 아닙니다.

위의 노트에서 논의된 바와 같이, 프로토콜의 중요한 측면은 VLP 생산을 위한 올바른 세포 표현형을 유지하고 SAMHD1 제한을 관찰하기 위한 적절한 환경을 조성하는 데 중점을 둡니다. 첫째, 2색 유세포분석에 의한 제한의 정확한 분석은 분석을 위해 플롯의 각 영역에 충분한 세포가 있도록 형질도입 및 감염된 세포의 적절한 비율을 달성하는 데 의존합니다. 따라서 연구원은 1 미만의 MOI를 목표로해야합니다 ( 프로토콜 참조). 형질도입 및 감염률이 너무 높거나 낮으면 감염되지 않거나 이중으로 감염된 세포가 없기 때문에 분석에 문제가 발생합니다. 마찬가지로, SAMHD1 벡터에 대한 유사한 형질도입 속도는 동일한 보상 매트릭스와 게이팅을 전체 실험에 적용하여 후속 분석에 대한 신뢰도를 높이는 데 중요합니다.
둘째, 사용된 U937 세포의 나이는 성공적으로 분화하는지 여부에 대한 핵심 요소입니다. 성공적인 분화는 순응도 관찰, 분화 후 시간이 지남에 따라 배지의 산성화 감소 및 분석에서 야생형 양성 대조군에 의한 적절한 제한을 통해 모니터링할 수 있습니다. 최대 5 일의 차별화가 성공했습니다.
이 분석의 주요 이점 중 하나는 유연성입니다. SAMHD1의 다양한 변형 버전(도메인, 아미노산, 종 서열)은 벡터의 간단한 부위 지향 돌연변이유발 또는 클로닝을 통해 테스트할 수 있습니다. 마찬가지로 테스터 바이러스의 변종을 탐색할 수 있습니다. 이 분석은 dNTP에 결합하는 능력이 감소된 HIV-1 역전사효소 돌연변이체가 SAMHD1 제한에 더 민감하다는 것을 입증하기 위해 이전에 사용되었습니다. SAMHD1에 의한 다른 바이러스의 제한을 테스트하기 위해 동일한 원리를 사용할 수 있습니다. 또한 다양한 분화 조건 또는 세포 내 dNTP 농도의 인공 조작을 사용하여 세포 내 조건과 SAMHD1 활성 간의 상호 작용을 추가로 조사할 수 있으며, 이는 Bishop 실험실에서 활발한 연구 영역입니다. SAMHD1과 다양한 뉴 클레오 시드 역전사 효소 억제제의 상호 작용이 또한 설명되었으며,이 분석을 사용하여 나타난 SAMHD1의 효과는 1 차 세포12,13,14,15에서 사용하도록 변형되었습니다.
일차 세포에서 사용하기 위한 프로토콜의 적응은 형질전환 세포에서 대사 표현형을 검사함으로써 제기되는 한계를 극복합니다. 그러나 기존 형식은 특히 고처리량 샘플러가 있는 유세포분석기를 사용하여 고처리량 분석을 위한 편리하고 기술적으로 덜 어려운 프로토콜을 허용합니다. 프로토콜을 조정할 때, 방관자 효과 (예 : 면역 신호 전달)에 대한 내부적으로 형질 도입되지 않은 세포의 감수성을 고려해야합니다.
세포 생물학의 여러 측면과 마찬가지로 이러한 분석은 주어진 현상을 이해하기 위한 전체론적 접근 방식의 일부로 사용되는 것이 필수적입니다. SAMHD1 활성16에 대한 생화학적 분석의 병행, 세포 내 dNTP 풀의 정량화, 인간, 생체 외 및 동물 모델에서 SAMHD1 돌연변이 표현형 관찰(전 세계 실험실에서 수행, 일부는 이번 호에 설명됨)은 이 복잡한 단백질에 대한 진화하는 이해의 핵심입니다.

멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 골수성 계통의 정지 세포에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1)의 복제를 방해합니다. SAMHD1은 dNTP 트리포스포하이드롤라제로서의 효소 활성을 통해 복제를 차단하여 세포 내 dNTP 수준을 감소시킵니다. 결과적으로 HIV-1은 역전사 과정을 효율적으로 수행 할 수 없습니다. 이 초기 관찰 이후 몇 년 동안 특히 SAMHD1의 항 바이러스 활성에 대한 특정 도메인과 아미노산의 기여와 관련하여 많은 진전이있었습니다. 이러한 통찰력은 생리학적으로 관련된 정지 골수성 환경을 모방한 세포 시스템뿐만 아니라 생화학적 분석을 사용하여 이루어졌습니다. U937 세포1 은 SAMHD1 활성을 분석하기위한 편리한 골수 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 이는 내인성 SAMHD1 발현이 부족하기 때문이며, SAMHD1 발현 세포(진행 중인 연구 영역)에 비해 RNA 수준이 낮기 때문인 것으로 생각됩니다. 여기서, 프로토콜은 HIV-1의 SAMHD1 제한 메커니즘을 조사하기 위해 SAMHD1과 황색 형광 단백질(YFP) 리포터를 동시 발현하는 바이러스 유사 입자를 가진 U937 세포의 일시적인 형질도입을 설명합니다. 레트로바이러스 제한을 조사하기 위한 이러한 일시적인 2색 유세포분석 분석은 Stoye 실험실2 에서 처음 개발되었으며 이후 삼자 모티프(TRIM) 단백질3을 포함한 다른 제한 인자를 조사하도록 조정되었습니다. 이러한 분석에서 영감을 얻은 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1 제한을 분석하기 위한 2색 분석을 개발했습니다.
실험의 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. IRES로부터 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 암호화하는 바이시스트로닉 메시지를 함유하는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는데 사용된다. 그런 다음 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도합니다. 세포는 다음으로 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 2색 유세포분석법으로 분석한다. 이 분석은 YFP 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 함께 사용되므로 유세포분석 분석을 위한 표준 필터 조합이 덜 필요합니다. HIV-RFP를 사용하면 보다 직접적인 보상이 가능하므로 경험이 적은 유세포분석 사용자가 분석에 더 쉽게 접근할 수 있고 대부분의 세포분석기로 달성할 수 있습니다.
분석하는 동안 HIV 감염 세포의 비율을 SAMHD1 발현 세포와 동일한 세포 웰 내에서 SAMHD1이 부족한 세포 간에 비교합니다. 이것은 핵심 기능인 웰/유세포 분석 튜브의 내부 제어를 제공합니다. 형질도입된 세포와 형질도입되지 않은 세포에서의 감염 수준의 비교는 제한 비율을 나타낸다. 1.0의 비율은 형질도입된 인자가 감염성에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 야생형 SAMHD1 발현은 이 분석에서 HIV 감염의 5배 감소를 유도하며, 이는 0.2의 제한 비율에 해당합니다. 이 효과는 TRIM5와 같은 보다 고전적인 제한 인자에 비해 미미하지만, 그럼에도 불구하고 효과는 재현 가능하며 변형된 SAMHD1 발현자를 야생형 단백질과 동등한 방식으로 제한하는 표현자, 제한하지 않는 표현자 및 중간 표현형을 갖는 표현자로 분류할 수 있습니다.
이 분석은 돌연변이 SAMHD1 서열을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 도메인 및 아미노산 돌연변이체의 제한 표현형을 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 이 분석에서 제한하지 못한다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, HIV-1 역전사효소 돌연변이체는 SAMHD1-매개 제한(예를 들어, 151V4)에 더 민감하다. 이 프로토콜은 바이러스 유사 입자 (VLP) 생산, SAMHD1 발현 벡터를 사용한 U937의 형질 도입, 형광 리포터를 운반하는 HIV 감염 및 유세포 분석에 의한 후속 분석의 세부 사항을 설명합니다. 이 문서에서는 예상되는 데이터와 최적이 아닌 결과를 방지하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, SAMHD1, dNTP 수준 및 바이러스 감염 간의 상호 작용을 보다 철저하게 이해하기 위해 다양한 SAMHD1 변이체를 검사하는 것 외에도 분석의 대체 용도가 간략하게 설명됩니다. 세포 대사의 중심에서 SAMHD1의 역할과 암과의 추가 연관성을 감안할 때 이것은 계속해서 강렬한 관심 분야입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FCT122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td>alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>ATCC recommends Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP-231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>-</td>
			<td>alternative analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Any bright field light microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (4 % in PBS)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKB4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1eYFP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY 
			FP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pVSV-G</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw-cap tubes</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1415-2231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCRPSY</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10084450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stripettes 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Trypsin will also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbofect</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0531</td>
			<td>alternative transfection reagents will also work well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of samhd1 restriction by flow cytometry in human myeloid u937 cells

멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 정지 골수성 세포에서 HIV-1의 복제를 억제합니다. U937 세포는 SAMHD1 RNA 발현 수준이 낮아 검출할 수 없는 내인성 단백질 발현으로 이어지는 SAMHD1 활성을 분석하기 위한 편리한 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 다른 레트로바이러스 제한 인자를 특성화하기 위해 Stoye 실험실에서 개발된 유사한 분석을 기반으로 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1을 분석하기 위한 2색 제한 분석을 개발했습니다. 뮤린 백혈병 IRES에서 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 발현하는 바이러스 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는 데 사용됩니다. 이어서, 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도한다. 분화 후, 세포는 형광 리포터를 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 유세포분석에 의해 분석한다. SAMHD1 발현 집단에서 HIV 감염 세포의 비율은 SAMHD1이 결핍 된 내부 대조군 세포의 비율과 비교됩니다. 이 비교는 제한 비율을 나타냅니다. SAMHD1 발현은 0.2의 제한 비율에 해당하는 HIV 감염을 5 배 감소시킵니다. 최근 HIV 감염에 대한 리포터 유전자로 원래 GFP에 대한 RFP를 대체함으로써 유세포 분석 분석이 용이해졌습니다.
이 분석은 발현 벡터의 부위 지향 돌연변이 유발에서 유래된 변경된 SAMHD1 단백질을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 제한에 대한 아미노산 치환의 효과를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 제한 활성의 손실을 나타내는 1의 제한 표현형을 나타낸다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 이 분석은 SAMHD1, 세포 대사 상태 및 바이러스 제한 간의 관계를 더 잘 이해하기 위해 분화 상태, 대사 상태 및 SAMHD1 변형제의 효과를 통합하도록 추가로 조정할 수 있습니다.

위의 분석 결과는 야생형 SAMHD1 양성 대조군의 경우 0.25 이하, 음성 대조군의 경우 1.0의 제한 비율을 산출해야 합니다. 이 두 가지 품질 관리 검사가 유효하다면 결과의 통계적 유의성을 고려하십시오. 따라서 야생형과 유의미한 차이가 없는 SAMHD1 변이체는 이러한 맥락에서 SAMHD1 제한에 영향을 미치지 않는 치환을 수행합니다. 야생형과 크게 다른 것은 손상된 제한을 보여줍니다. 이들이 음성 대조군과 크게 다르지 않다면 이러한 맥락에서 제한할 수 있는 능력이 부족합니다(그림 4 왼쪽 패널).
야생형 SAMHD1 제한 값이 0.3보다 크면 테스터 바이러스에 대한 결과가 지표가 될 수 있지만 신뢰할 수는 없습니다. 야생형 단백질에 의한 비효과적인 제한은 U937 세포를 재구성 후 회복 후 너무 일찍 사용하거나(2주 이내) 너무 오래된(>2-3개월) 사용할 때 발생할 수 있습니다. 이들 파라미터는 주어진 세포 스톡에 대해 경험적으로 결정될 필요가 있을 수 있다. 전형적으로, 계대가 낮을수록, 세포가 더 안정적으로 분화하고, 따라서 SAMHD1 제한에 대한 적절한 환경을 제공한다. SAMHD1-YFP 또는 HIV-RFP의 부적절한 감염 수준은 또한 보상 및 제한 비율의 다운스트림 결정 모두에 어려움을 초래할 수 있습니다. 그림 4의 오른쪽 패널에 예가 나와 있습니다.
음성 대조군이 1.0(0.9-1.2 범위 밖)에서 벗어나면 분석에 문제가 있거나 감염된 세포의 비율, 게이팅 전략 또는 세포의 건강이 분석에 영향을 미치므로 나타낼 수 있습니다. 위의 참고 사항을 참조하십시오.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig01.jpg"> 그림 1: 회로도 개요 프로토콜. VLP, 바이러스 유사 입자, PMA, 포볼 미리 스테이트 아세테이트. 번호가 매겨진 단계는 프로토콜의 단계에 해당합니다. BioRender.com 사용하여 제작 된 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig02.jpg"> 그림 2: 레트로바이러스 플라스미드의 개략도 . (A) 패키징 벡터 (B) 전달 벡터 (C) VSV-G 엔벨로프 익스프레서. 키 코딩 및 규제 요소가 표시됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. CMV IE: 거대세포 바이러스 즉시-초기 프로모터, BGH: 소 성장 호르몬, pA: polyA, RRE: Rev 반응 요소, CMV-LTR: 복합 CMV-HIV-1 LTR 프로모터, Psi: HIV-1 패키징 신호, cPPT/CTS: 중앙 폴리퓨린 관/중앙 종결 서열, SV40: 유인원 액포 바이러스 40. BioRender.com 사용하여 제작 된 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig03.jpg"> 그림 3: 유세포분석 분석을 위한 게이팅 전략. (A) 보상 제어: 왼쪽 패널은 형질도입되지 않고 감염되지 않은 대조군에 대한 택트 내 세포에 대한 FSC-A/SSC-A 게이팅을 보여줍니다. 중앙 및 오른쪽 패널에는 보정되지 않은 데이터가 검은색으로 표시되고 보정된 YFP(중간) 및 RFP(오른쪽)에 대한 단색 보정 컨트롤의 스크린샷이 표시됩니다. (B) 위의 보상 통제에 대한 해당 보상 매트릭스 및 플롯. (C) 게이팅 전략. 파편은 FSC-A/SSC-A(왼쪽 패널)에 의한 모든 세포의 분석을 통해 제거됩니다. 더블릿은 FSC 높이 대 면적(중앙 패널)의 게이팅으로 제외됩니다. 오른쪽 패널은 야생형 SAMHD1에 의한 HIV-1 제한의 예를 보여줍니다. 축은 각각 YFP(SAMHD1) 및 RFP(HIV) 양성 세포에 해당하는 보정된 청색 및 황색 레이저 형광을 보여줍니다. 사분면 게이트는 RFP 및 YFP에 대한 네거티브 및 단색 컨트롤의 비교를 통해 그려집니다. 숫자는 부모 인구의 백분율을 나타냅니다. GFP를 사용하는 YFP에 대한 보정 값은 훨씬 더 높지만 적절한 필터 세트를 사용하여 구별할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62502/62502fig04.jpg"> 그림 4: 예상 결과: 이상적인 데이터와 최적이 아닌 데이터. (A) 최적(왼쪽) 및 차선(오른쪽) 데이터에 대한 대표적인 YFP/RFP 플롯. 숫자는 부모 인구의 백분율을 나타냅니다. 오른쪽 패널에서 HIV 감염이 너무 낮아 보상 및 게이팅에 어려움이 있습니다. 제한 비율이 0.5로 예상보다 높습니다. (B) 통계 소프트웨어를 사용하여 생성된 야생형(WT, 적색) 또는 음성 대조군(HD206-7AA, 흑색)에 대한 SAMHD1의 변이체에 대한 제한비의 플롯. 각 점은 반복실험 값을 나타냅니다. 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 각 그룹 간의 쌍체 t-검정은 표시된 모든 경우에 유의했습니다. 왼쪽: 이상적인 데이터 - WT는 약 0.2의 예상 제한을 나타내고 음수는 1.0을 나타냅니다. 변종 R372D (회색)는 WT와 유의하게 다르지만 음성 대조군과는 유의하지 않으므로 제한 능력을 상실했습니다. 오른쪽: 최적이 아닌 데이터. 여기서 음성은 예상대로 동작하지만 6번의 반복 실험 모두에서 WT는 감염률이 낮기 때문에 제한 비율이 0.5에 불과합니다. 그룹 내의 낮은 분산은 R143H가 WT 및 음성과 통계적으로 다른 중간 표현형을 나타내는 반면 G209S는 제한하지 않음을 의미합니다. 그러나 양성 대조군이 예상 제한 비율을 제공하지 않았기 때문에 신선한 세포로 반복해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62502/62502fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

여기에 설명된 것은 세포 억제 단백질 SAMHD1에 의한 HIV-1 제한의 정도를 결정하기 위한 확립된 방법입니다. 인간 골수성 계통 U937 세포는 YFP를 공동 발현하는 SAMHD1 발현 벡터로 형질도입되고, 분화된 후 HIV-RFP로 도전된다. 제한의 수준은 유세포 분석 분석에 의해 결정된다.

인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

대식세포의 HIV 감염에서 세포 인자의 역할에 대한 관심이 증가함에 따라 특히 U937 세포에서 발현되지 않는 SAM HG 1에 대한 유연한 분석 시스템을 개발했습니다. 이 시스템의 가장 큰 장점은 유연성입니다. 설정이 완료되면 다양한 단백질, 세포 또는 표적 바이러스를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.세포의 건강을 유지하고 다색 유세포분석에 익숙해지는 것이 중요합니다. 분석을 시작하기 10 분 전에 세포 분석기와 컴퓨터를 켜십시오. 폐기물이 비어 있고 외피 탱크가 가득 찼는지 확인하십시오.그런 다음 로그인하여 분석 소프트웨어를 엽니다. 팔을 움직인 후 물 튜브를 제거하십시오. 유량을 높음으로 설정하고 프라임을 누릅니다.불이 꺼질 때까지 기다렸다가 이 과정을 세 번 더 반복합니다. 물 튜브를 다시 놓고 3 분 동안 높은 유속으로 움직입니다. 그런 다음 유량을 낮음으로 설정하고 획득할 때까지 대기를 누릅니다.실험, 새 실험을 선택하고 확인을 눌러 빈 실험을 선택하고 실험을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 표본을 추가합니다. 확인을 눌러 빈 패널로 이동합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 적절한 이름으로 이름을 바꾸고 더하기 기호를 클릭하여 시편을 열어 새 튜브를 표시합니다.튜브를 두 번 클릭하면 인스펙터에서 세포분석기 설정을 볼 수 있습니다. 매개변수 메뉴에서 청색 레이저 53030 및 황색 레이저 61020을 제외한 불필요한 형광 색소를 삭제합니다. 워크시트에서 해당 아이콘을 클릭하고 축 레이블을 클릭하여 축을 변경하여 전방 분산 영역 대 측면 산점도 도트, YFP 히스토그램, RFP 히스토그램 및 RFP 대 YFP 점도표를 만듭니다.감염되지 않은 변환되지 않은 컨트롤을 로드하고 컴퓨터에서 run을 누릅니다. 그런 다음 획득 대시보드에서 획득을 누릅니다. 대시보드에서 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 셀을 왼쪽 아래 사분면에 배치합니다.이 인구 주위에 게이트를 만들고 P one으로 표시합니다. 다른 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 P one 표시를 선택하여 후속 분석에서 파편을 제거합니다. 피크가 히스토그램의 왼쪽에 오도록 RFP 및 YFP 전압을 아래로 조정합니다.YFP용 단색 컨트롤을 로드하고 획득을 누릅니다. 대부분의 형광 셀이 검출기 범위 내에 있도록 대시보드에서 YFP 전압을 조정합니다. 그런 다음 RFP 컨트롤에 대해 동일한 작업을 반복합니다.실험을 선택합니다. 보정 설정으로 이동하여 보정 컨트롤 만들기를 선택하고 확인을 선택하여 일반 워크시트로 전환한 다음 얼룩이 없는 일반 워크시트를 선택합니다. 실행을 누르고 얼룩지지 않은 컨트롤을 획득하십시오.온전한 세포 주위에 게이트 P를 그리고 기록합니다. 튜브를 제거하고 기계를 대기 상태로 두십시오. P one을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.모든 보상 컨트롤에 적용을 클릭하고 RFP 일반 워크시트로 전환합니다. 실행을 누르고 단색 RFP 제어를 기록하면 소프트웨어가 자동으로 양극 셀을 게이트합니다. 기기를 대기 상태로 설정하고 YFP 제어에 대해 동일한 작업을 반복합니다.실험을 선택하고 보정 설정으로 이동하여 보정 계산을 선택한 다음 링크를 클릭하고 저장합니다. 전역 워크시트로 전환하고 시편 튜브로 돌아갑니다. HIV RFP에 감염된 야생형 SAM HD 1로 형질도입된 세포를 획득하고, YFP 및 RFP에 대해 수직 및 수평으로 정렬된 사분면의 모서리에서 4개의 별개의 집단을 볼 수 있는지 확인한다.튜브를 제거하고 대기 모드를 누릅니다. 형질전환되지 않고 감염되지 않은 샘플을 다시 로드하고 실행을 누릅니다. 획득 대시보드에서 정지 게이트를 P 1로 설정하고 이벤트를 설정하여 30, 000개의 이벤트를 기록합니다.녹음을 누릅니다. 각 튜브 사이의 다음 튜브를 눌러 다른 샘플 및 대조군에 대해 동일한 작업을 반복합니다. 실행 중 또는 사후 호크 중에 샘플의 이름을 바꾸고 데이터를 dot FCS 파일로 내보냅니다.소프트웨어를 열고 모든 FCS 파일을 대시 보드로 드래그하십시오. 보정 컨트롤을 선택하고 보정 하위 폴더로 드래그합니다. 변환되지 않은 감염되지 않은 튜브를 두 번 클릭하여 파일을 열고 전방 산란 대 측면 산란 플롯을 수행합니다.다각형 도구를 선택하고 왼쪽 아래 모서리에 있는 파편을 제외한 온전한 세포 집단을 게이트하고 이름을 셀로 지정합니다. 셀을 가리지 않도록 레이블을 이동합니다. 이 게이트를 모든 표본 막대의 전체 튜브 모집단으로 끕니다.수평 화살표 버튼을 사용하여 전체 모집단을 스크롤하여 각 튜브에 적절한 게이팅을 확인하십시오. 셀을 두 번 클릭하고 축을 높이 대 영역으로 조정합니다. 직사각형 게이트를 사용하여 단일 큰 모집단을 선택하여 이중선을 제외하고 소프트웨어가 자동으로 단일 셀로 이름을 지정하도록 제안합니다.그런 다음 이 게이트를 모든 세포 모집단으로 끌어 놓고 게이팅이 모든 샘플에 적합한지 확인합니다. 감염되지 않은 형질도입된 샘플에 대한 단일 세포 집단을 선택합니다. Y축을 YFP에 대해 보정된 청색 레이저로 변경하고 X축을 RFP에 대해 보상된 노란색 레이저로 변경합니다.사분면 게이팅 도구를 선택하고 음수 셀 모집단의 오른쪽 위 극단을 클릭합니다. 이 예비 게이팅을 모든 샘플 막대의 부모 게이트로 끌어 모든 단일 세포 집단에 적용합니다. 사분면 게이트가 모집단을 만족스럽게 분리하지 못하면 다각형 도구를 사용하여 개별 사분면을 게이트합니다.야생형 SAM HD 원온리 샘플로 스크롤하여 형질도입되지 않은 YFP 음성 셀과 YFP 양성 셀 사이의 올바른 게이팅을 확인합니다. 등고선 보기를 사용하여 음수 세포를 희미한 YFP 세포와 구별합니다. 모든 샘플에 유효한 YFP 음성과 양성 간의 최상의 분할을 사용하고 샘플을 스크롤하여 YFP 양성과 관련하여 게이팅을 확인합니다.형질도입되지 않은 HIV RFP 감염 샘플로 스크롤하여 감염되지 않은 RFP 음성과 감염된 RFP 양성 사이의 게이팅이 올바른지 확인합니다. 필요한 경우 등고선 보기를 사용하고 나머지 샘플을 스크롤하여 게이팅이 모든 샘플에 유효한지 확인합니다. 각 샘플에는 4개의 사분면이 필요합니다.Q1 YFP 양성, Q2 이중 양성, Q3 RFP 양성 및 Q4 이중 음성. 테이블 편집기를 열고 4개의 사분면 게이트를 대시보드로 끕니다. 드롭다운에서 파일을 선택하고 엑셀을 선택합니다.파일 대상을 선택하고 테이블 생성을 클릭하십시오. 생성된 스프레드시트를 로컬 파일 명명 규칙에 따라 저장합니다. 배치 편집기 아이콘을 클릭하여 플롯 및 게이팅 전략의 표현을 내보냅니다.각 모집단을 선택하고 필요한 축, 레이블 및 간격을 사용하여 편집기로 드래그합니다. 배치 섹션 아래의 모든 샘플에 대해 표시된 동일한 플롯으로 배치를 생성하려면 열에 하나를 입력하고 배치 보고서 작성을 누릅니다. 파일 메뉴에서 너비에 맞게 배율을 선택하고 페이지 나누기를 방지합니다.그런 다음 필요한 파일 형식으로 저장합니다. 내보낸 스프레드시트에서 텍스트 원고에 설명된 대로 열을 생성합니다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 각 SAM HD 하나의 구성에 대한 복제 데이터의 평균을 구하고 제한 비율 값을 계산합니다.최적 및 차선의 데이터에 대해 대표적인 YFP 대 RFP 플롯이 생성되었습니다. 최적이 아닌 데이터 플롯은 HIV 감염이 너무 낮아 보상 및 게이팅에 어려움을 겪었음을 나타냅니다. 제한비율은 0.5로 예상비율 0.3보다 높았다.야생형 및 음성 대조군에 대하여 SAM HD의 변이체에 대한 제한 비율의 플롯을 최적 및 차선의 데이터에 대해 생성하였다. 최적 데이터에서, 야생형은 대략 0.2의 예상 제한을 나타내었고, 음성 대조군 HD 206 내지 7 AA는 1.0의 제한비를 가졌다. 변이체 R372D는 야생형과 유의하게 상이하였으나, 음성 대조군과는 유의하게 상이하지 않았으며 제한하는 능력을 상실하였다.차선의 데이터에서 음성 대조군은 예상대로 행동했지만 야생형은 낮은 감염률로 인해 0.5의 제한 비율을 보였습니다. R143D는 야생형 및 음성 대조군과 통계적으로 상이한 중간 표현형을 보였다. 변이체 G209S는 야생형과 유의하게 상이하였으나 음성 대조군과는 유의하게 상이하지 않았고, 따라서 제한하는 능력을 상실하였다.특히 유세포분석을 처음 접하는 경우 많은 대조 세포를 보유하는 것이 중요합니다. 이에 따라 또는 병렬로 동일한 돌연변이 체의 생화학 적 분석을 수행하여 전체 론적 그림을 형성 할 수 있습니다.