Abstract
Immunology and Infection
멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 정지 골수성 세포에서 HIV-1의 복제를 억제합니다. U937 세포는 SAMHD1 RNA 발현 수준이 낮아 검출할 수 없는 내인성 단백질 발현으로 이어지는 SAMHD1 활성을 분석하기 위한 편리한 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 다른 레트로바이러스 제한 인자를 특성화하기 위해 Stoye 실험실에서 개발된 유사한 분석을 기반으로 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1을 분석하기 위한 2색 제한 분석을 개발했습니다. 뮤린 백혈병 IRES에서 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 발현하는 바이러스 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는 데 사용됩니다. 이어서, 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도한다. 분화 후, 세포는 형광 리포터를 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 유세포분석에 의해 분석한다. SAMHD1 발현 집단에서 HIV 감염 세포의 비율은 SAMHD1이 결핍 된 내부 대조군 세포의 비율과 비교됩니다. 이 비교는 제한 비율을 나타냅니다. SAMHD1 발현은 0.2의 제한 비율에 해당하는 HIV 감염을 5 배 감소시킵니다. 최근 HIV 감염에 대한 리포터 유전자로 원래 GFP에 대한 RFP를 대체함으로써 유세포 분석 분석이 용이해졌습니다.
이 분석은 발현 벡터의 부위 지향 돌연변이 유발에서 유래된 변경된 SAMHD1 단백질을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 제한에 대한 아미노산 치환의 효과를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 제한 활성의 손실을 나타내는 1의 제한 표현형을 나타낸다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 이 분석은 SAMHD1, 세포 대사 상태 및 바이러스 제한 간의 관계를 더 잘 이해하기 위해 분화 상태, 대사 상태 및 SAMHD1 변형제의 효과를 통합하도록 추가로 조정할 수 있습니다.
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