Ces travaux ont été soutenus par miur (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 à MG) et par POR Calabria FESR 2014-2020, action 1.2.2, « INNOPROST ».

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique institutionnelle de l’Université Magna Graecia de Catanzaro, RP 41/2018. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients inscrits à l’étude.
1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Centrifugeuses EPS-urine échantillons dans les 2 h de collecte à 2.100 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT). Conserver le surnatant à -80 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>2. Décongélation de l’échantillon
<ol><li>Transférer l’échantillon de -80 °C à -20 °C la veille de la digestion.</li>
	<li>Avant le traitement de l’échantillon, transférer l’échantillon pendant 15 à 20 minutes à 4 °C, puis à RT.</li>
</ol>3. Préparation des reagents pour la FASP
<ol><li>Le même jour, préparez les solutions suivantes : tampon d’urée, 50 mM d’iodoacetamide (IAA) en tampon urée, bicarbonate de triéthylammonium de 50 mM et dithiothreitol (TNT) de 50 mM.</li>
	<li>Préparer tampon urée (urée 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): pour 10 mL, peser 4800 mg d’urée et le dissoudre dans la quantité appropriée d’eau HPLC après avoir ajouté 1 mL de 1 M Tris pH 8. Un volume de 800 μL d’urée est nécessaire pour chaque échantillon.</li>
	<li>Préparer 500 mM de dithiothreitol (TNT) : dissoudre 38,5 mg de TNT dans 500 μL d’eau HPLC. Pour chaque échantillon, 66,7 μL de TNT sont nécessaires.</li>
	<li>Préparer 50 mM IAA dans Urea Buffer: dissoudre 9,25 mg d’IAA dans 1 mL de tampon urée. Pour chaque échantillon, 50 μL d’IAA sont nécessaires.</li>
	<li>Préparer 50 mM de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB). Ajouter 150 μL de 1 M TEAB à 2,85 mL d’eau HPLC. Pour chaque échantillon, 460 μL de TEAB sont nécessaires.</li>
	<li>Préparer une solution de trypsine (100 ng/μL) dans l’eau HPLC. Cette solution peut être stockée à -80 °C et décongelée immédiatement avant utilisation. Pour chaque échantillon, 2 μL (200 ng) sont nécessaires.</li>
</ol>4. Digestion des protéines par FASP
<ol><li>Diluer 500 μL de chaque échantillon d’EPS-urine avec 66,7 μL de 10 % (w/v) de sulfate de dodédecyl de sodium (SDS), 66,7 μL de TNT de 500 mM et 33,3 μL de 1 M Tris pH 8 pour solubiliser les protéines et réduire les liaisons disulphidées. Incuber 10 minutes à 95 °C avec une douce secousse.</li>
	<li>Ajouter 300 μL d’échantillon dilué d’EPS-urine sur l’unité filtrant (10 kDa) et centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 minutes.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon d’urée au filtre et à la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 15 minutes. Répétez cette étape, puis jetez le flux à travers.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de solution IAA et centrifugeuse à 6 000 x g pendant 25 minutes.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon d’urée et de centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 minutes. Répétez cette étape, puis jetez le flux à travers.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon bicarbonate de triéthylammonium de 50 mM (TEAB) et centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 minutes. Répétez cette étape.</li>
	<li>Transférer l’unité de filtre dans un nouveau tube de collecte.</li>
	<li>Ajouter 60 μL de tampon TEAB de 50 mM et 200 ng de trypsine et incuber l’échantillon dans un thermo-mélangeur à 37 °C pendant la nuit. REMARQUE : Pour éviter l’évaporation de l’échantillon pendant l’incubation pendant la nuit, enveloppez chaque unité de filtre d’une couche de papier d’aluminium, puis d’une couche de parafilm.</li>
	<li>Après l’incubation de la trypsine, ajouter 140 μL d’eau et centrifuger le flacon à 14 000 x g pendant 25 minutes pour recueillir le volume de digestion (180-200 μL).</li>
</ol>5. Préparation des reagents pour la purification SCX
<ol><li>Préparer 1 mL de lavage 1 (0,5 % d’acide formique (FA) et 20 % d’acétyltrile (ACN)) comme suit : ajouter 50 μL de 10 % de FA et 200 μL de 100 % d’ALC à 750 μL d’eau HLPC. Pour chaque échantillon, 100 μL de lavage 1 sont nécessaires.</li>
	<li>Préparez 1,5 mL de lavage 2 (0,5 % fa et 80 % d’ACN) comme suit : ajouter 75 μL de 10 % de FA et 1,2 mL de 100 % d’ACN à 225 μL d’eau HPLC. Pour chaque échantillon, 190 μL de lavage 2 sont nécessaires.</li>
	<li>Préparer 100 μL de solution d’élutation (500 mM d’acétate d’ammonium (AA) et 20 % d’ACN ) : ajouter 25 μL de 2 M AA et 20 μL de 100 % d’ALC à 55 μL d’eau HPLC.</li>
	<li>Préparez StageTips comme suit.<ol>
<li>Emballez une pointe de pipette de 200 μL avec une couche de résine SCX à l’aide d’une aiguille de seringue à extrémité émoussée (jauge 16). Insérez le StageTip dans un couvercle de microcentrifugeuse qui a déjà été percé afin d’accueillir le microcoumn.</li>
		<li>Assembler le couvercle sur une microcentrifugeuse de 2 mL à partir de laquelle le couvercle d’origine a été enlevé. Le dispositif centrifuge micro-SPE qui vient d’être assemblé doit s’insérer dans une centrifugeuse benchtop. Puisque les couvercles perforés sont fastidieux à préparer, ils peuvent être utilisés plusieurs fois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Purification SCX
<ol><li>Diluer 30 μL de chaque échantillon à 120 μL à l’aide du lavage 2.</li>
	<li>Conditionner le StageTip en ajoutant 50 μL de lavage 1 sur le dessus de la résine d’extraction et de la centrifugeuse à 400 x g pendant 2 minutes. Étant donné que la résistance au débit dépend de la force avec laquelle la résine d’extraction a été emballée dans la pointe de la pipette, la vitesse de centrifugeuse peut devoir être ajustée afin d’obtenir un débit de 20-30 μL/min. Essayez de ne pas laisser la pointe sèche pendant le chargement et le lavage de l’échantillon.</li>
	<li>Equilibrer le StageTip avec 50 μL de lavage 2 et centrifugeuse à 400 x g pendant 2 minutes.</li>
	<li>Chargez l’échantillon dilué (120 μL) à l’aide d’une vitesse de rotation inférieure.</li>
	<li>Laver le StageTip avec 50 μL de lavage 2 et centrifugeuse à 400 x g pendant 2 minutes. Répéter l’année avec 50 μL de lavage 1. REMARQUE : Après ce lavage, la résine doit être complètement sèche.</li>
	<li>Mélange de peptides élitus avec 7 μL de solution élitiste (acétate d’ammonium de 500 mM (AA) et 20% d’ACN) lentement à l’aide d’une vitesse de rotation inférieure.</li>
	<li>Ajouter 27 μL de 0,1 % de FA pour diluer l’AA et obtenir un échantillon pour l’injection préliminaire de LC-MS/MS. La dilution finale à 34 μL se traduira par un rapport volumerique de 1:1 entre l’urine et la solution peptidique (1 μL de digeste purifié correspondra à 1 μL d’échantillon d’urine d’origine).</li>
</ol>7. Quantification des protéines par norme externe à l’aide de l’analyse du PDD( figure 2)
<ol><li>Déterminer la quantité de protéines dans les échantillons en injectant 2 μL du peptide digeste qui en résulte dans LC-MS/MS et en interpolant la zone totale de peptide qui en résulte avec une courbe d’étalonnage construite comme suit :</li>
	<li>Préparer cinq solutions de digestion HeLa différentes (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) à l’aide d’un stock de digeste HeLa (100 μg/μL).</li>
	<li>Injecter chaque solution Hela en double (2 μL).</li>
	<li>Définissez la méthode LC-MS/MS.<ol>
<li>Injecter 2 μL des cinq mélanges de peptides HeLa et des peptides séparés à travers un gradient linéaire de 75 minutes à un débit de 230 nL/minute sur une colonne de 15 cm, 75 μm i.d emballée avec 3 particules de silice C18 de μm. Utilisez un gradient binaire constitué par la phase A mobile (0,1% FA, 2% ACN) et la phase B mobile (0,1% FA et 80% d’ACN).</li>
		<li>Effectuez l’éution du gradient en augmentant le contenu de phase B mobile de 6 % à 42 % en 60 minutes et de 42 % à 100 % en 8 minutes supplémentaires. Maintenir pendant 5 minutes 100% B, puis revenir à 0% B en deux minutes.</li>
		<li>Fonctionnez en mode DDA à l’aide d’une méthode top-12 et réglez la plage complète de balayage ms à 350-1800 m/z,résolution 70 000, cible ACG 1e6 et temps d’injection maximum 50 ms. Réglez la fenêtre de masse pour l’isolement des ion précurseurs à 1,6 m/z,résolution 35 000, cible ACG 1e5, temps d’injection maximum 120 ms, fragmentation du HCD à 25 RCE (énergie de collision normalisée) et exclusion dynamique 15 secondes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser les fichiers bruts à l’aide de Sequest comme moteur de recherche, et la séquence de protéines HUMAN Uniprot Complete comme base de données. Dans les expériences présentées ici, la base de données a été téléchargée en mars 2016 et contenait 42.013 séquences.<ol>
<li>Utilisez les paramètres suivants : tolérance à la SP 15 ppm, tolérance à la SP/SP 0,02 Da, trypsine en tant qu’enzyme en fixant deux sites de clivage manqués. Réglez la carbamidomethylation de la lysine, de la sérine, de la thréonine, de la tyrosine (+57.021) et de l’oxydation des méthionines comme modifications dynamiques et de la carbamidomethylation des cystéines (+57.021) comme modifications statiques. Utilisez le cut-off du taux de fausse découverte (FDR) pour l’identification des peptides et des protéines à 0,01 et filtrez par percolateur.</li>
		<li>Calculez la zone de pointe pour tous les signaux peptidique MS1. Calculer la superficie totale des peptides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injectez 2 μL de mélanges peptidiques obtenus à partir d’échantillons d’EPS-urine en utilisant la même méthode LC-MS/MS utilisée pour les échantillons HeLa et analysez le fichier brut en utilisant les mêmes paramètres utilisés pour le traitement des données HeLa.</li>
	<li>Calculer l’intensité totale des signaux peptidiques en résumant les valeurs de surface de tous les peptides identifiés et en interpolant la courbe standard externe. Ceci fournira une estimation acceptable de la quantité de peptide présente dans le digest de protéine d’EPS-urine.</li>
</ol>8. Préparation des reagents pour le protocole C18 StageTip
<ol><li>Préparer 500 μL de solution A (0,1% d’acide trifluoroacétique (AFE), 50% d’ACN): ajouter 250 μL de 100% d’ACN et 10 μL de 5% de TFA à 240 μL d’eau HPLC.</li>
	<li>Préparer 2 mL de solution B (0,1 % de TFA) : ajouter 40 μL de 5 % d’ALE à 1960 μL d’eau HPLC.</li>
	<li>Préparez 100 μL de solution d’élucation (0,1 % FA, 50 % ACN) : ajoutez 1 μL de 10 % de FA et 50 μL d’EAU 100 % ACN à 49 μL d’eau HPLC.</li>
	<li>Préparez StageTips tel que décrit précédemment. Dans ce cas, des disques d’extraction C18 sont utilisés.</li>
</ol>9. Protocole SCX/C18 StageTip
REMARQUE : Purifier les digestes EPS-urine par protocole C18 StageTip pour enlever les sels.
<ol><li>Commencez à partir de 2 μg de peptides (quantifiés par l’injection préliminaire). Diluer la solution digeste 4 fois dans le lavage 2 SCX et procéder comme décrit ci-dessus (dans la section « PURIFICATION SCX »). Elute le mélange de peptides avec 7 μL de solution d’élitate (500 mM d’acétate d’ammonium (AA) et 20% d’ACN) lentement à l’aide d’une vitesse de rotation inférieure (débit de 5 μL/min).</li>
	<li>Acidifier l’évasif SCX avec 150 μL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique (AFE) afin d’atteindre un pH inférieur à 3 et une concentration de solvant organique inférieur à 5 %.</li>
	<li>Conditionner le C18 StageTip avec 50 μL de solution A et centrifugeuse à 400 x g pendant 2 minutes. Equilibrate C18 StageTip avec 50 μL de solution B et centrifugeuse à 400 x g pendant 2 minutes.</li>
	<li>Chargez l’échantillon sur la pointe de la scène lentement à l’aide d’une vitesse de rotation inférieure.</li>
	<li>Laver le C18 StageTip avec 50 μL de solution B et centrifugeuse.</li>
	<li>Épuutez lentement le mélange de peptides avec 10 μL de solution d’élitution à l’aide d’une vitesse de rotation inférieure.</li>
	<li>Sécher l’élitate (10 μL) à 30 °C dans une centrifugeuse sous vide pendant 3 minutes. Ajouter 47 μL de 0,1 % de FA. La concentration prévue de peptide sera de 40 ng/μL. Analyser par LC-MS/MS en mode DIA.</li>
</ol>10. Analyse DIA (Figure 3)
<ol><li>séparation nanoLC : Séparez le mélange de peptides à l’aide d’un gradient linéaire de 140 minutes à un débit de 230 nL/min sur une colonne d’identification de 15 cm et 75 μm remplie de particules de silice C18 de 3 μm.<ol>
<li>Effectuez l’elution du gradient à un débit de 230 nL/minute et augmentez le contenu mobile de phase B de 3 % à 25 % en 90 minutes, puis de 25 % à 40 % en 30 minutes et enfin de 40 % à 100 % en 8 minutes.</li>
		<li>Après 10 minutes à 100% B, équilibrer la colonne avec la phase A mobile pendant 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paramètres spectrométriques de masse : effectuer l’analyse DIA à l’aide d’une méthode utilisant le cycle d’analyse suivant : (i) un événement complet de SEp à une résolution de 17 500 (cible AGC 1e6, temps d’injection maximum 50 ms) suivi de (ii) 20 fenêtres à 20 m/z largeur d’isolement, à partir de m/z 350, (ii) 5 fenêtres à 50 m/z largeur d’isolement et (iv) 1 fenêtre à 200 m/z largeur d’isolement, mettant fin à la plage de balayage de DIA à 1200 m/z. Effectuez des analyses DIA à la résolution 35 000 (cible AGC 5e5, temps d’injection maximum de 120 ms et 25 RCE).</li>
</ol>11. Fractionnement de phase C18 inversé à pH élevé pour la génération de bibliothèques
REMARQUE : Collecte d’échantillons représentatifs d’EPS-urine d’une quantité supérieure à 10 μg afin de construire une bibliothèque dépendante des données pour l’analyse DIA par la procédure suivante :
<ol><li>Acidifier le mélange de peptides (11 μg) de 0,2 % de tfa et charger la solution qui en résulte sur un C18 StageTip rempli de deux couches de disques d’extraction pour permettre une plus grande capacité. Nous avons estimé que la capacité de chargement d’un seul micro disque (à partir d’une aiguille de seringue de calibre 16) se trouverait dans la fourchette de 5 à 10 μg.</li>
	<li>Condition et équilibrement de la phase stationnaire comme déjà décrit pour la purification du C18.</li>
	<li>Effectuer la fractionnement peptidique par elution progressive (n=10) à partir de la phase C18 inversée à pH élevé à l’aide de solutions d’élitution contenant 0,2 % de l’hydroxyde d’ammonium, 10 mM TEAB, et augmentation des concentrations v/v d’ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).</li>
	<li>Analyser les 10 fractions à l’aide des mêmes paramètres chromatographiques de la méthode DIA. Actionner le spectromètre de masse en mode DDA en utilisant les paramètres précédemment adoptés pour l’analyse préliminaire (voir « Quantification des protéines par norme externe à l’aide de l’analyse du PDD »).</li>
</ol>12. Analyse des données
<ol><li>Générer la bibliothèque spectrale en important les résultats d’identification des protéines obtenus à partir des expériences DDA LC-MS/MS de fractionnement C18 de phase à haut inversé dans un logiciel dédié à l’analyse DIA.</li>
	<li>Réglez le nombre minimum et maximum d’ions fragmentaires utilisés pour l’identification et la quantification à 3 et 6, respectivement. Filtrez les résultats obtenus par une valeur Q de 0,01.</li>
	<li>Importer des fichiers bruts DIA et associer à chaque fichier brut le même fichier FASTA utilisé pour créer la bibliothèque spectrale.</li>
	<li>Réglez le nombre minimum et maximum de peptides uniques utilisés pour la quantification des protéines à 1 et 10, respectivement.</li>
	<li>Calculez l’intensité de chaque protéine en résumant la zone de pic iion fragmentaire.</li>
	<li>Générer une matrice avec l’intensité des protéines quantifiées dans chaque échantillon.</li>
</ol>

<ol>
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W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics.">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li><li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions.">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li></ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Dans ce travail, une stratégie d’analyse des échantillons d’EPS-urine est présentée. Le protocole FASP est un choix idéal pour la protéomique urinaire, car il permet la concentration de l’échantillon avant la digestion enzymatique. En fait, à l’aide de ce flux de travail, plusieurs centaines de microlitres d’urine peuvent être chargés sur un seul filtre et traités. En outre, la digestion sur filtre offre une relative liberté dans le choix des conditions de dénaturation. Dans nos travaux, la dénaturation des protéines est obtenue en diluant des échantillons d’urine dans un tampon contenant tris, SDS et TNT (concentration finale : 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM TNT). Les protéines sont efficacement dénaturées immédiatement après la décongélation de l’échantillon, afin d’éviter une dégradation non désirée par des protéases actives. Le protocole FASP original a été amélioré en augmentant le volume de lavages de 100 μL à 200 μL. De cette façon, un meilleur retrait des résidus, en particulier des détergents du filtre, est réalisé.
Après la digestion enzymatique, l’estimation des protéines par norme externe à l’aide d’une méthode rapide LC-MS/MS, dépendante des données, est effectuée avant les dernières étapes du protocole, qui comprennent la purification à double étape et l’analyse LC-MS/MS en mode DIA, sur un matériau de départ égal pour tous les échantillons (2 μg).
La polyvalence du FASP est associée à l’approche DIA, une méthode sensible fournissant un faible nombre de valeurs manquantes17. Dans nos travaux, 2387 protéines ont été identifiées et quantifiées, permettant ainsi de prétenterner un profil protéomique détaillé de l’EPS-urine. L’identification et la quantification de 2387 protéines ont été possibles grâce à la génération d’une riche bibliothèque spectrale, obtenue par fractionnement inversé à pH élevé des peptides, et par notre méthode DIA, dirigée vers une large gamme de précurseurs m/z. Ce flux de travail a identifié plus de 80% des protéines précédemment trouvées dans l’analyse directe d’EPS, démontrant qu’une fraction considérable du protéome EPS-urinaire est en effet dérivée des sécrétions prostatiques exprimées, est donc une source riche des protéines spécifiques de tissu de prostate26.
En conclusion, notre conception expérimentale couple la polyvalence de FASP avec la sensibilité de DIA afin d’obtenir une carte riche du protéome urinaire. Cette stratégie est recommandée pour l’analyse des échantillons d’EPS-urine, mais son utilisation peut être étendue à la protéomique urinaire en général, ou même à d’autres types d’échantillons.

L’évolution constante des technologies protéomiques promet d’avoir un impact considérable en aidant le diagnostic de la maladie et la prédiction de la réponse au traitement en fournissant des cartes à haute résolution des principaux effecteurs moléculaires présents dans une grande variété d’échantillons tels que les tissus et les biofluides. D’un point de vue analytique, l’urine offre plusieurs avantages tels que la facilité de collecte et la stabilité majeure du protéome par rapport aux autres biofluides1. L’analyse protéomique de l’urine est d’un intérêt particulier pour les études de découverte de biomarqueurs sur les cancers urologiques, car elle permet l’échantillonnage non invasif à proximité des tissusd’intérêt 2. En particulier, un échantillon qui semble prometteur pour l’étude des pathologies liées à la prostate est l’EPS-urine3,4 (c.-à-d., un échantillon d’urine prélevé après un examen rectal numérique (ERD)). Cette dernière opération avant la collecte de l’échantillon enrichit l’urine de protéines spécifiques à la prostate. Eps-urine est un bon candidat pour étudier les troubles liés à la prostate5, y compris le cancer de la prostate (PCa), puisque par ERD, les protéines sécrétées par la tumeur peuvent être versées dans l’échantillon d’urine, augmentant les chances de détecter les protéines spécifiques aux tissus du cancer.
Un rôle crucial dans la détection et la quantification des biomarqueurs protéiques potentiels est joué par spectrométrie de masse (SP). Au cours des deux dernières décennies, les protocoles d’analyse protéomique basés sur la SP ont permis de détecter un nombre sans cesse croissant de protéines dans une seule course LC-MS/MS grâce à des améliorations continues de l’instrumentation de la SP et du logiciel d’analysedes données 6.
La préparation de l’échantillon protéomique à base de SP implique généralement une digestion enzymatique du mélange protéique, qui peut être obtenue par le biais d’une grande variété de protocoles tels que : digestion en solution, ballonnements MStern7,piégeage de suspension (piège À S)8, préparation d’échantillons à phase solide améliorée (SP3)9, digestion in-StageTip10 et préparation d’échantillons aidés par filtre (FASP)11. Tous les protocoles peuvent être utilisés pour la protéomique urinaire, même si les résultats peuvent varier en ce qui concerne le nombre de protéines et peptides identifiés et en termes de reproductibilité12.
Dans ce travail, notre attention s’est concentrée sur l’analyse de l’EPS-urine par le protocole FASP. Le protocole FASP a été initialement conçu pour analyser les protéines extraites des tissus et des cultures cellulaires, mais son utilisation a ensuite été étendue à l’analyse d’autres types d’échantillons, tels que l’urine13. En ce qui concerne la digestion simple dans la solution FASP est une approche protéomique plus flexible14, car en réalisant l’élimination efficace des détergents et d’autres contaminants tels que les sels du mélange de protéines avant la digestion enzymatique15, il permet le choix des conditions optimales de solubilisation des protéines. De plus, une autre caractéristique du FASP est qu’il fournit un moyen de concentration de l’échantillon. Ceci est particulièrement intéressant pour l’analyse protéomique urinaire, car il permet de commencer à partir de volumes d’échantillons relativement importants (des centaines de microlitres). À la lumière du potentiel du protocole FASP, plusieurs études ont attiré l’attention sur l’automatisation des flux de travail, dans le but de réduire la variabilité expérimentale et de traiter un nombre élevé d’échantillons enparallèle 16.
Dans notre flux de travail, fasp est suivi par l’acquisition de LC-MS/MS dans l’analyse data-independent (DIA), qui fournit une couverture protéome élevée, une bonne précision quantitative et une faible incidence des valeurs manquantes. L’approche DIA est une méthode sensible où tous les ions sont sélectionnés pour les événements de SP/SP, contrairement à ce qui se passe dans l’analyse dépendante des données (DDA) où seuls les ions ayant la plus forte intensité sont fragmentés. Le spectromètre de masse, fonctionnant en mode DIA, effectue des cycles de balayage avec une largeur d’isolement différente couvrant toute la plage de précurseurs m/z. Cette approche permet de détecter de façon reproductible un nombre élevé de peptides par unité de temps, fournissant un instantané protéomique de l’échantillon17. En outre, les données générées par DIA ont une autre caractéristique intéressante : la possibilité d’une analyse posteriori 18. Les données dia sont plus complexes que celles obtenues par DDA, parce que les spectres MS/MS dans DIA résultent du co-isolement de plusieurs ions précurseurs dans chaque fenêtre m/z 19. Démêler les spectres composites ms/MS en signaux peptidiques distincts et spécifiques est atteint en utilisant deux éléments fondamentaux : une bibliothèque spectrale et un logiciel dédié à l’analyse des données. La bibliothèque spectrale est générée par une expérience dépendante des données, impliquant habituellement la fractionnement peptidique pour maximiser la couverture protéome, qui fournit une liste de milliers d’ions précurseurs déterminés expérimentalement et de spectres ms/MS de peptides détectables dans l’échantillon à l’étude. Le logiciel d’analyse des données utilise plutôt les informations contenues dans la bibliothèque spectrale pour interpréter les données DIA en générant des chromatogrammes iion extraits spécifiques qui permettent la détection et la quantification du peptide. Bien que l’analyse des données DIA sans bibliothèque soit maintenant possible, dia basée sur la bibliothèque fournit toujours de meilleurs résultats en termes de couverture protéome20.
Le protocole de préparation de l’échantillon décrit ici (figure 1) se compose des étapes suivantes : une étape de centrifugation (pour enlever les débris cellulaires), la digestion fasp, la purification de StageTip21,la quantification des protéines et l’analyse dia. Ce protocole a été conçu pour l’analyse de l’EPS-urine dans le contexte de la découverte de biomarqueurs du cancer de la prostate, mais il peut être appliqué à l’analyse protéomique de n’importe quel échantillon d’urine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris HCL pH 8.0</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-iodoacetamide for synthesis</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047440100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile for HPLC LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>318612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Cation 47mm Extraction Disks</td>
			<td>Microcolumn</td>
			<td>2251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid optima</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela Protein Digest Standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>MRCPRT010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71736-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiethylammonium bicarbonate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T6567-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>U6504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water HPLC gradient grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W/0106/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer 1,4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut 14.0</td>
			<td>Biognosys</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profile of eps-urine through fasp digestion and data-independent analysis

Le protocole d’échantillonnage assisté par filtre (FASP) est largement utilisé pour la préparation d’échantillons protéomiques, car il permet de concentrer les échantillons dilués et il est compatible avec une grande variété de détergents. Les workflows protéomiques ascendants comme fasp s’appuient de plus en plus sur les méthodes LC-MS/MS effectuées en mode analyse indépendante des données (DIA), une méthode de numérisation qui permet une couverture protéométique profonde et une faible incidence des valeurs manquantes. 
Dans ce rapport, nous fournirons les détails d’un flux de travail qui combine un protocole FASP, une étape de purification à double étape et LC-MS/MS en mode DIA pour la cartographie des protéomes urinaires. Comme échantillon modèle, nous avons analysé les sécrétions prostatiques exprimées (EPS)-urine, un échantillon recueilli après un examen rectal numérique (DRE), qui est d’intérêt dans les études de découverte de biomarqueurs de cancer de la prostate.

Ce protocole pour l’analyse protéomique urinaire comprend les étapes suivantes : digestion FASP, estimation de la quantité de protéines par étalonnage standard externe, double purification de l’étape (SCX et C18)et analyse LC-MS/MS en mode DIA.
Après digestion des protéines, des injections préliminaires sont effectuées après la purification de StageTip SCX des peptides qui en résultent. Les fichiers bruts LC-MS/MS sont traités pour obtenir le nombre de peptides identifiés, le nombre de protéines identifiées et la zone des peptides détectés. La superficie totale obtenue en résumant tous les peptides identifiés est utilisée pour estimer la teneur en protéines par interpolation selon une norme externe : un digest protéique HeLa injecté à cinq quantités différentes (2, 5, 15, 50, 150 ng, respectivement). La quantité de protéines pour les six échantillons analysés dans cette étude variait d’un échantillon à l’autre, montrant une valeur moyenne de 78 ng/μL.
Après estimation des protéines, 2 μg de protéines digérées de chaque échantillon sont purifiées par SCX séquentiel et C18 StageTip avant analyse DIA. La bibliothèque spectrale de recherche de données DIA est créée après fractionnement de phase inversée à pH élevé et analyse DDA LC-MS/MS d’un échantillon représentatif (p. ex., un pool d’échantillons). À l’aide des paramètres décrits ci-dessus, nous avons identifié et quantifié, cumulativement, 2 387 groupes protéiques dans les six échantillons d’EPS-urine àl’étude (tableau supplémentaire 1 et figure 4).
Afin d’évaluer d’un point de vue qualitatif la pertinence de la liste des protéines identifiées et quantifiées, la matrice obtenue a été comparée à une liste de 624 protéines précédemment identifiées dans direct-EPS22, un échantillon prélevé dans une procédure plus invasive, qui s’est avérée être une source intéressante de biomarqueurs candidats intéressants de cancer de la prostate. Au total, 508 protéines sur 624 ont été détectées avec succès par notre protocole FASP/DIA sur l’EPS-urine.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg"> Figure 1 :Flux de travail protéomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg"> Figure 2: Représentation de notre conception expérimentale pour la quantification des protéines basée sur la norme externe (HeLa digest). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg"> Figure 3: Étapes clés de l’analyse dia : (i) élaboration de la bibliothèque spectrale par fractionnement de phase inversée à pH élevé et analyse de dda, (ii) analyse d’échantillon utilisant l’approche DIA, (iii) analyse de données par Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg"> Figure 4: Parcelle classée pour les protéines EPS-urinaires détectées. Quelques hits sélectionnés sont étiquetés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Tableau représentatif des protéines quantifiées dans six échantillons d’EPS-urine dans Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette table.</a>

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Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Ici, nous présentons un protocole optimisé de digestion sur filtre avec des informations détaillées sur les éléments suivants : digestion des protéines, purification du peptide et analyse d’acquisition indépendante des données. Cette stratégie est appliquée à l’analyse des échantillons de sécrétions prostatiques exprimées-urine et permet une couverture protéome élevée et un profilage sans étiquette de faible valeur manquante du protéome urinaire.

Profil protéomique de l’EPS-Urine grâce à la digestion FASP et à l’analyse indépendante des données

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

Le protocole FASP est une approche intéressante de votre protéomique urinaire en raison de sa compatibilité avec les tampons fortement dénaturants et en raison de sa capacité à concentrer l’échantillon sur le filtre, ce qui est essentiel pour un échantillon de protéines diluées. Le protocole FASP couplé avec la spectrométrie de masse d’analyse indépendante des données nous permet d’atteindre une couverture protéométrique profonde dans l’EPS-urine, qui est l’urine recueillie après examen rectal numérique. Nous appliquons actuellement la méthode que vous êtes sur le point de voir dans un effort de découverte de biomarqueurs sur le cancer de la prostate.La procédure sera présentée par Licia Prestagiacomo, Paola Morelli et Caterina Gabriele. Centrifugeuse EPS-urine échantillons dans les deux heures de collecte pendant 10 minutes à 2100 RCF à température ambiante. Ensuite, conservez les supernatants à moins 80 degrés centigrades jusqu’à utilisation.Jetez les échantillons sur la glace, ou à quatre degrés. Pour accélérer la procédure, vous pouvez transférer les échantillons de moins 80 à moins 20 la veille de la digestion. En tant que solutions de stock, vous aurez besoin de 500 millimolar DTT, 10%SDS, un tampon tris molaire au pH huit.Diluer 500 microlitres de chaque échantillon d’EPS-urine avec 67 microlitres de SDS, 67 microlitres de TNT et 33 microlitres de tampon Tris. Incuber à 95 degrés centigrades pendant 10 minutes avec des secousses douces. Assembler l’unité de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire daltonien de 10 000 daltoniens.Ajouter ensuite 300 microlitres d’échantillon dilué d’EPS-urine au filtre. Centrifugeuse à 14 000 g pendant environ 20 minutes. Vous pouvez interrompre temporairement la procédure après environ 15 minutes afin de vérifier si la filtration se déroule sans heurts.Continuez jusqu’à ce que toute la solution soit passée à travers le filtre. Ensuite, ajouter 200 microlitres de tampon d’urée et de centrifugeuse à 14 000 g pendant 15 minutes. Répétez cette étape une deuxième fois.Lorsque le flow-through est sur le point de toucher le filtre, vider la collection Eppendorf en pipetting le flux à travers. Les protéines sont sans danger sur le filtre. Pour l’alkylation cystéine, préparer une solution d’iodoacétamide immédiatement avant l’utilisation.Pesez environ 10 milligrammes d’iodoacétamide dans un certain nombre de flacons d’Eppendorf et dissolvez-le dans le tampon d’urée à une concentration de 9,25 milligrammes par ml, ou en termes de molaire, 50 millimolaire. Ajouter 50 microlitres de solution d’iodoacétamide à chaque filtre et centrifugeuse à 6000 g pendant 25 minutes. La vitesse de centrifugation inférieure permettra aux filtres de ne pas sécher.Après l’alkylation des protéines, laver les filtres avec deux aliquots de 200 microlitres consécutifs de tampon d’urée et de centrifugeuse à 14 000 g pendant 20 minutes. Jetez le flux à travers. Ajouter 200 microlitres de 50 millimillons trois tampons et centrifugeuses en ammonium éthylique à 14 000 g pendant 20 minutes.Répétez cette étape. Après avoir terminé complètement le dernier lavage au bicarbonate, transférez l’unité de filtre dans un nouveau tube de collecte. Ajouter ensuite 60 microlitres de tampon TEAB de 50 millimères.Ajouter un microlitre de solution trypsine à une concentration de 200 nanogrammes par microlitre de trypsine. Vous pouvez également préparer le tampon de digestion pour tous les échantillons dans un flacon d’Eppendorf et distribuer 61 microlitres du tampon de digestion à chaque filtre. Si vous utilisez un ThermoMixer afin d’éviter l’évaporation de l’échantillon pendant l’incubation pendant la nuit, enveloppez chaque unité de filtre avec une couche de papier d’aluminium, puis une couche de parafilm.Incuber les échantillons à 37 degrés pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez les filtres sur une centrifugeuse du dessus du banc pour une rotation très courte. Après avoir tourné, ouvrir les couvercles d’Eppendorf et ajouter 140 microlitres d’eau.Centrifugeuse les flacons à 14 000 g pendant 25 minutes, afin de recueillir les peptides. Le volume recueilli devrait être d’environ 190 microlitres. Afin d’éliminer les traces de SDS du digeste, une forte purification d’échange de cation des peptides avant LC-MS-MS est recommandée.Préparez les supports en microcolumn en perçant les couvercles Eppendorf avec un outil pointu comme une paire de pinces ou de ciseaux. Le support pourra accueillir le microcoumn pendant la centrifugation. Puisqu’ils sont fastidieux pour préparer, les supports peuvent être utilisés plusieurs fois.À l’aide d’un émoussé et d’une aiguille, retirer une plaque du disque d’extraction approprié. Les disques d’extraction sont des matériaux polymériques mous contenant des particules sorbentes. Dans ce cas, le sorbent est fait de particules avec de fortes propriétés d’échange de cation.Accueillir la plaque dans une pointe de pipette de 200 microlitres. À l’aide d’un piston, poussez la prise vers l’extrémité de la pointe. Le petit disque doit être poussé fermement, mais en évitant une force excessive.Insérez la pointe dans le support et assemblez le microcoumn spin à l’aide d’un flacon Eppendorf de deux millilitres à partir duquel le couvercle d’origine a été retiré. La prise à partir d’une aiguille de jauge 16 aura une capacité de chargement d’environ cinq microgrammes de peptides. Conditionner le microcoumn avec deux lavages consécutifs.La vitesse appropriée dépendra de la force avec laquelle vous poussez le disque dans la pointe pipette. Visez à atteindre un débit de l’ordre de 20 à 30 microlitres par minute. Essayez de ne pas faire sécher la pointe pendant les lavages et pendant le chargement de l’échantillon.Diluer l’échantillon cinq fois dans la solution de lavage deux et charger les résultats dans la solution à une vitesse plus lente. Visez un débit d’environ 15 à 20 microlitres par minute. Si nécessaire, jetez le flux.Laver les détergents résiduels. Ensuite, laissez le disque sécher avant l’élitution peptidique. Transférer le microcoumn dans un tube propre de 1,5 Eppendorf et ajouter immédiatement l’élitiste.Qui sera sept microlitres d’une solution d’acétate d’acétate de munitions de 500 millimlaires contenant 20% d’acétylonitrile. Diluer l’élixate avec 27 microlitres d’acide 0,1% formic afin de réduire le pourcentage de solvant organique, puis injecter deux microlitres de la solution résultante dans LC-MS-MS avec détection en mode dépendant des données. Les détails sur la configuration LC-MS utilisée dans ce protocole seront donnés plus tard dans la vidéo.Après avoir effectué la recherche de base de données et l’intégration des erreurs peptidique, calculez la zone de pointe globale. Ensuite, comparez-le à une courbe standard externe pour estimer la concentration de peptide dans le digeste FASP. Après avoir estimé la quantité de peptide, purifier un nouvel aliquot de fasp digest correspondant à deux microgrammes de peptides par deux purifications consécutives stageTip comme décrit ici.La configuration LC-MS utilisée dans ce protocole est basée sur l’injection directe dans la colonne analytique. Si vous utilisez un système avec une colonne de piégeage, vous pouvez éviter l’étape de purification hors ligne C18. N’oubliez pas d’utiliser des aiguilles et des pistons dédiés pour chaque matériau chromatographique.Après avoir éludé les peptides de la pointe de l’étape C18 avec 10 microlitres d’élitent, évaporez partiellement l’élitate dans une centrifugeuse sous vide pendant quelques minutes, en essayant d’éviter l’évaporation complète. Ensuite, ajoutez 47 microlitres d’acide formique de 0,1 % et placez la solution qui en résulte dans un flacon HPLC pour l’analyse LC-MS. Le système utilisé ici est basé directement sur le chargement de l’échantillon de colonne sans utiliser une colonne de piégeage.Les colonnes analytiques sont faites à l’interne en tirant un capillaire d’identification de 75 micromètres après avoir enlevé un morceau de revêtement en polyamide. La pointe qui en résulte peut être légèrement formée à l’aide d’un coupeur en céramique. Le capillaire est ensuite placé dans une bombe d’emballage et emballé avec un lisier isopropanol de 50 milligrammes par ml de C18 trois micromètres de particules de phase stationnaire.Une pression de gaz comprise entre 10 et 20 barres d’azote ou d’hélium est nécessaire. Vous pouvez utiliser des colonnes de chromatographie alternatives ou commerciales fonctionnant au débit de sous-microlitre par minute. Assemblez la colonne sur un morceau de T.Les deux autres extrémités sont reliées à l’alimentation à haute tension et à la boucle HPLC. Évaluez la tension optimale de pulvérisation en exécutant le système au débit isocratique. Ensuite, commencez votre analyse.Séparez les peptides sur un gradient chromatographie de deux heures tel qu’il est affiché. L’acquisition de données consistera en une analyse rapide du service complet de SP suivie de 26 analyses MS-MS sur des fenêtres précurseurs de largeur variable. À partir de 20 m/z de largeur, pour les 20 premières fenêtres qui couvriront une plage de m/z de 350 à 750 Thompson.Puis passer à une largeur de 50 m/z pour les cinq fenêtres suivantes et se terminer par un seul balayage MS-MS, ayant une largeur d’isolement de 200 Thompson. Des largeurs plus étroites représentent une région plus peuplée du spectre en termes de présence de précurseurs peptidiques. Pour l’analyse DIA, vous aurez besoin d’une bibliothèque spectrale.Afin de générer une bibliothèque spectrale, vous pouvez effectuer quelques expériences dépendantes des données sur le même système LC-MS-MS que vous avez utilisé pour l’acquisition dia en utilisant le même gradient chromatographie. La fractionnement de l’échantillon augmentera la couverture protéome. Les conseils d’étape peuvent être utilisés pour la fractionnement de l’échantillon.L’échange fort de cation et la phase inverse de base sont deux alternatives valides. Commencez par les 10 microgrammes d’un pool de plusieurs digestes FASP. Acidifier l’échantillon à l’aide d’une concentration finale de 0,2 % de l’AFE.Chargez les peptides sur des pointes d’étape C18 de grande capacité. Utilisez plusieurs disques en cas de quantités élevées de peptide. Pour 10 microgrammes de matière, deux disques sont recommandés.Effectuez la purification C18 comme décrit précédemment. Préparez plusieurs flacons pour une collection d’éludage. Autant que le nombre de fractions.Dans ce cas, 10 fractions sont produites par elution stepwise. Après le dernier lavage, ajouter 20 microlitres du premier élitiste. Hydroxyde d’ammonium de 0,2%, TEAB de 10 millimlaires, 4% acétyonitrile.Après avoir complètement élucidé la première fraction dans le premier Eppendorf, déplacez la pointe de scène vers le flacon de collection suivant. Diluer en 20 étapes de microlitres en utilisant comme eluent, 0,2% de l’hydroxyde d’ammonium, 10 millimolaire TEAB, puis augmenter la quantité d’acétylonitrile. Après avoir fractionné l’échantillon et réalisé des expériences dépendantes des données sur chaque fraction, générer votre bibliothèque spectrale par recherche de base de données des données MS-MS.La bibliothèque sera ensuite importée dans un logiciel capable d’analyse de données DIA pour la quantification des protéines sur la base d’un minimum d’un peptide unique attribué par un minimum de trois transitions. Attendez-vous à couvrir un large éventail de protéome urinaire. Ce chiffre montre l’identification et la quantification des protéines dans une fourchette d’abondance, couvrant cinq ordres de grandeur.Le workflow présenté ici combine l’avantage de concentration et la polyvalence du protocole FASP avec la sensibilité du mode de numérisation DIA. Cette combinaison fournit une carte riche du protéome urinaire. Étant donné que notre configuration d’analyse n’inclut pas l’utilisation d’une colonne de piégeage, le digest FASP a été purifié par un échange de cation fort et des conseils de phase inversée.L’étape étapes inversées Conseils d’étape peut être omise lorsqu’une colonne de piégeage est connectée directement à la colonne analytique. L’utilisation de ce flux de travail est recommandée pour l’analyse des échantillons d’EPS-urine, mais son utilisation peut être étendue à la protéomique urinaire en général.

Profil protéomique de l’EPS-Urine grâce à la digestion FASP et à l’analyse indépendante des données

Abstract