Tre metodi di analisi dell'espressione differenziale per il sequenziamento dell'RNA: limma, EdgeR, DESeq2

Summary

È stato fornito un protocollo dettagliato di metodi di analisi dell'espressione differenziale per il sequenziamento dell'RNA: limma, EdgeR, DESeq2.

Abstract

Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) è una delle tecnologie più utilizzate nella trascrittomica in quanto può rivelare la relazione tra l'alterazione genetica e processi biologici complessi e ha un grande valore nella diagnostica, nella prognostica e nella terapia dei tumori. L'analisi differenziale dei dati RNA-seq è fondamentale per identificare trascrizioni aberranti e limma, EdgeR e DESeq2 sono strumenti efficienti per l'analisi differenziale. Tuttavia, l'analisi differenziale RNA-seq richiede determinate abilità con il linguaggio R e la capacità di scegliere un metodo appropriato, che manca nel curriculum di educazione medica.

Qui forniamo il protocollo dettagliato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) tra il colangiocarcinoma (CHOL) e i tessuti normali attraverso limma, DESeq2 e EdgeR, rispettivamente, e i risultati sono mostrati in grafici vulcanici e diagrammi di Venn. I tre protocolli di limma, DESeq2 e EdgeR sono simili ma hanno passaggi diversi tra i processi di analisi. Ad esempio, un modello lineare viene utilizzato per le statistiche in limma, mentre la distribuzione binomiale negativa viene utilizzata in edgeR e DESeq2. Inoltre, i dati normalizzati del conteggio RNA-seq sono necessari per EdgeR e limma, ma non sono necessari per DESeq2.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per tre metodi di analisi differenziale: limma, EdgeR e DESeq2. I risultati dei tre metodi sono in parte sovrapposti. Tutti e tre i metodi hanno i loro vantaggi e la scelta del metodo dipende solo dai dati.

Introduction

Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) è una delle tecnologie più utilizzate nella trascrittomica con molti vantaggi (ad esempio, un'elevata riproducibilità dei dati) e ha notevolmente aumentato la nostra comprensione delle funzioni e delle dinamiche di processi biologici complessi^1,2. L'identificazione di trascritti ablati in diversi contesti biologici, noti anche come geni differenzialmente espressi (DEG), è un passo chiave nell'analisi RNA-seq. RNA-seq consente di ottenere una profonda comprensione dei meccanismi molecolari e delle funzioni biologiche correlate alla patogenesi. Pertanto, l'analisi differenzia....

Protocol

NOTA: Aprire il programma R-studio e caricare il file R "DEGs.R", il file può essere acquisito da file / script supplementari.

1. Download e pre-elaborazione dei dati

1. Scarica i dati di conteggio del sequenziamento ad alto rendimento (HTSeq) del colangiocarcinoma (CHOL) da The Cancer Genome Atlas (TCGA). Questo passaggio può essere facilmente ottenuto con il seguente codice R.
   1. Fare clic su Esegui per installare i pacchetti R.
   2. Fare clic su Esegui per caricare i pacchetti R.
      if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
      + install.packages("BiocManager")
      BiocManager::i....

Discussion

Abbondanti trascrizioni ablate nei tumori possono essere facilmente identificate dall'analisi differenziale RNA-seq⁵. Tuttavia, l'applicazione dell'analisi dell'espressione differenziale RNA-seq è spesso limitata in quanto richiede determinate abilità con linguaggio R e la capacità di scegliere metodi appropriati. Per affrontare questo problema, forniamo un'introduzione dettagliata ai tre metodi più noti (limma, EdgeR e DESeq2) e tutorial per l'applicazione dell'analisi dell'espressione differ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
R		version 3.6.2	free software
Rstudio			free software