تم دعم هذا العمل ماليا جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، 31900395 ، 31971985 ، 31901430) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية ، ومختبر هاينان ياتشو باي للبذور (JBGS ، B21HJ0403) ، ومؤسسة هاينان الإقليمية للعلوم الطبيعية في الصين (320LH002) ، ومشروع JCIC-MCP.

1. إعداد حلول الترانسبوناز والمخزون (اليوم الأول)
ملاحظة: في هذا الجزء ، يتم تعقيد محولات oligonucleotide مع ترانسبوساز Tn5 لصنع transposase نشط.
<ol><li>تمييع الاشعال (التمهيدي A ، التمهيدي B ، والتمهيدي C) إلى تركيز 100 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت التلدين (10 mM Tris pH 8.0 ، 50 mM NaCl ، 1 mM EDTA)...

<ol>
	<li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+ENCODE.">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT&amp;Tag.">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&amp;Tag.</a> Plant Methods. 16, 120 (2020).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li><li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+CUT&amp;Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues.">Single-cell CUT&amp;Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+(Gossypium+spp.)+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis.">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).</li><li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT&amp;Tag.">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&amp;Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).</li><li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks.">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li></ol>

هنا ، وصفنا CUT & Tag ، وهي تقنية لتوليد مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط مقارنة بالترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). نجاحنا مع التنميط H3K4me3 في أوراق القطن يشير إلى أن CUT & Tag ، الذي تم تصميمه لأول مرة للخلايا الحيوانية ، يمكن استخ?...

تخدم مواقع الحمض النووي المرتبطة بعامل النسخ والكروماتين المفتوح المرتبط بعلامات تعديل الهيستون أدوارا وظيفية حاسمة في تنظيم التعبير الجيني وهي المحاور الرئيسية للبحوث اللاجينية1. تقليديا، تم استخدام مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) إلى جانب التسلسل العميق (ChIP-seq) لتحديد على نطاق الجينوم لتعديل هيستون كروماتين معين أو أهداف الحمض النووي مع بروتينات محددة، ويتم اعتماده على نطاق واسع في مجال علم الوراثة اللاجينية2. تم تطوير تقنية الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) في الأصل من قبل مختبر Henikoff لالتقاط شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين في جميع أنحاء الجينوم5. عند مقارنتها ب ChIP، يمكن ل CUT & Tagcan إنشاء مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط3. حتى الآن ، تم إنشاء طرق لتحليل مناطق الكروماتين مع تعديلات هيستون محددة باستخدام CUT & Tag في الخلايا الحيوانية4,5. على وجه التحديد ، تم أيضا تطوير CUT & Tag أحادي الخلية (scCUT & Tag) بنجاح للأنسجة والخلايا البشرية 6. ومع ذلك ، نظرا لتعقيد جدار الخلية والأيضات الثانوية ، لا يزال CUT & Tag يمثل تحديا تقنيا للأنسجة النباتية.
في السابق ، أبلغنا عن بروتوكول CUT & Tag باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allotetraploid 4. لإثبات كفاءة عزل النوى والتقاط الحمض النووي باستخدام الأنسجة النباتية ، يتم عرض إجراء التنميط هنا. وتشمل الخطوات الرئيسية عزل النوى سليمة، والحضانة في الموقع مع الجسم المضاد لتعديل الكروماتين، وحضانة الترانسبوساز، وتكامل المحول، وإعداد مكتبة الحمض النووي. يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على إعداد مكتبة CUT & Tag لعزل نوى النبات ومراقبة الجودة. 
في هذه الدراسة ، نقدم استراتيجية CUT & Tag المكررة للنباتات. نحن لا نقدم فقط بروتوكولا خطوة بخطوة لتنميط H3K4me3 في أوراق القطن ، ولكننا نقدم أيضا منهجية محسنة لعزل نوى النبات ، بما في ذلك استراتيجية اختيار تركيز المنظفات لتحلل الخلايا المناسب واستراتيجية تصفية النوى. يتم تضمين خطوات مفصلة مع تعليقات انتقادية أيضا في هذا البروتوكول المحدث.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K4me3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin (~50% (TLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M MgCl2 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539133-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M KCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 5 M NaCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermidine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 2 M spermidine stock solution, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 20% Triton X-100 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&#38;Tag</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S602/S603</td>
			<td>Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Amplify Enzyme</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>HS-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One&#160; spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation

يؤدي التنظيم اللاجينومي على المستوى اللوني ، بما في ذلك تعديلات الحمض النووي والهيستون ، وسلوكيات عوامل النسخ ، والحمض النووي الريبي غير المشفر مع بروتيناتها المعينة ، إلى التحكم الزماني والمكاني في التعبير الجيني. الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT & Tag) هو طريقة ربط الإنزيم التي يتم فيها التعرف على بروتين الكروماتين المحدد أولا بواسطة جسمه المضاد المحدد ، ثم يربط الجسم المضاد بروتين اندماج بروتين A-transposase (pA-Tn5) ، والذي يشق الكروماتين المستهدف في الموقع عن طريق تنشيط أيونات المغنيسيوم. هنا ، نقدم بروتوكول CUT & Tag المنشور سابقا باستخدام نوى سليمة معزولة من أوراق القطن allortetraploid مع التعديل. يمكن استخدام هذا البروتوكول خطوة بخطوة للأبحاث اللاجينومية في النباتات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تعديلات كبيرة لعزل نوى النبات مع تعليقات نقدية.

يوضح الشكل 1 سير عمل CUT & Tag. يوضح الشكل 2 تلطيخ DAPI للنوى السليمة. كان الهدف من خطوة "عزل النوى" هو الحصول على النوى السليمة بكمية كافية لتفاعل CUT & Tag اللاحق. يوضح الشكل 3 الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لمنتجات PCR. مطلوب عنصر التحكم السلبي IgG بالت...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation at JoVE.com

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

الانقسام تحت الأهداف ووضع العلامات (CUT & Tag) هو استراتيجية تنميط الكروماتين فوق الجينومية الفعالة. يقدم هذا البروتوكول استراتيجية CUT & Tag محسنة لتحديد ملامح تعديلات الهيستون في النباتات.

توصيف تعديل H3K4me3 في النباتات باستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

كان الهدف العام من التجربة هو تحديد شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين في جميع أنحاء الجينوم ، والتي تعكس حالة الكروماتين. ولتحقيق هذا الهدف، نفذت ثلاث عمليات خاصة. بادئ ذي بدء ، تم عزل النوى السليمة من الخلايا النباتية.ثانيا ، تم التعرف على التعديلات على الكروماتين بواسطة جسم مضاد محدد في الموقع. ثالثا ، الجسم المضاد الذي يربط بروتين اندماج A-transposase ، Tn5 transposase ، يشق الكروماتين في الموقع تحت تنشيط أيونات المغنيسيوم. ثم تم دمج شظايا الحمض النووي ومواقع ربط تعديل الكروماتين مع المحولات وأصبحت جاهزة لإعداد الحمض النووي.عزز إثراء تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسل التوليد. يؤدي تنظيم علم الجينوم اللاجيني على المستوى اللوني ، بما في ذلك تعديلات الحمض النووي والهيستون ، وسلوكيات عوامل النسخ ، والحمض النووي الريبي غير المشفر مع بروتيناته المجندة ، إلى التحكم الزماني والمكاني في التعبير الجيني. تقنية CUT & Tag التي طورها Henikoff Lab هي طريقة ربط إنزيم لتنميط الكروماتين epigenomics بكفاءة عالية.هنا نستخدم أوراق القطن كمواد تجريبية ، ولإجراء تنميط الكروماتين باستخدام الأجسام المضادة ل Histone H3 Lysine-4 Trimethylation كمثال. نحن نقدم بروتوكولا محسنا مع فيديو لأداء CUT & Tag في النباتات. لكل إعداد عينة باستخدام CUT & Tag ، تم جمع غرام من أنسجة أوراق القطن.تم طحن الورقة إلى مسحوق ناعم مع النيتروجين السائل ، ونقلها إلى أنبوب صقر سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من عازل العزل النووي المبرد A.تم خلط المحلول العازل بلطف ، وتم تحضين الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق مع اهتزاز لطيف لتفريق المادة بالتساوي. ثم تم نسجها عند 500 قوة طرد مركزي نسبية أو RCF ، عند 4 درجات مئوية ، لمدة خمس دقائق ، لتشكيل حبيبات الخلية. تم صب السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات مع 20 مل من العازل النووي المبرد B ، مع استكمال 0.5 ٪ تريتون.تم عكس الأنبوب بلطف لإعادة تعليق الكريات تماما. ثم تمت تصفية محللات الخلايا الناتجة بمزيج من اثنين من المناخل ، وتم استخدام غربال 500 شبكة في الأعلى لإزالة حطام الأنسجة الأكبر. وتم استخدام غربال 1000 شبكي في القاع لجمع النوى.يعتمد اختيار حجم الشبكة المناسب للغربال على حجم نوى النباتات. تم استخدام ورق ترشيح معقم على الجانب الخلفي من الغربال لامتصاص جزء من الليزات وحطام الخلايا الصغيرة. تم نقل الليزات التي تحتوي على النوى إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر ، ونسج عند 300 تريليون قدم مكعب لمدة أربع دقائق ، عند 4 درجات مئوية مئوية لجمع النوى.بعد الطرد المركزي ، تم استخدام طرف ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الفائقة. كمية 800 ميكرولتر ، تمت إضافة مخزن مؤقت للغسيل النووي. وتم عكس الأنبوب بلطف لإعادة تعليق النوى.تم نسج الأنبوب مرة أخرى عند 300 تريليون قدم مكعب ، لمدة أربع دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد ما مجموعه ثلاث غسلات ، تم دمج النوى الناتجة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر ، ونسجت عند 300 تريليون قدم مكعب ، لمدة أربع دقائق عند 4 درجات مئوية. تم استخدام طرف ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت المتبقي.كانت الخطوة التالية هي حضانة الجسم المضاد. تم إعادة تعليق أليكوت من 50 ميكرولتر من النوى في 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة المكمل ب EDTA و BSA وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني في الديجيتونين. تم وضع أليكوت من 150 ميكرولتر من تعليق النوى في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر لتفاعل واحد ، تمت إضافة ميكرولترين من الأجسام المضادة إلى كل أنبوب.في هذا الفحص ، تم إعداد نسختين بيولوجيتين للأجسام المضادة المضادة للهيستون H3-Lysine-4-Trimethylation ومجموعات التحكم السلبية في الغلوبولين المناعي G بعد إضافة الأجسام المضادة. تم خلط المحلول بلطف ، وتركت الأنابيب على شاكر أفقي للتهجين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في 12 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي ، تم إخراج الأنابيب وتم غسل النوى باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الأمطار المناعية.تم عكس الأنبوب بلطف للخلط وتم تركه على الخلاط الأفقي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في 12 دورة في الدقيقة. بعد الغسيل ، تم نسج الأنبوب عند 300 تريليون قدم مكعب لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تمت إزالة supernatant باستخدام طرف ماصة.وقد تكرر هذا لما مجموعه ثلاث غسلات. بعد الغسيل الثالث ، تم نسج الأنبوب 300 rcf لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، وتم استخدام طرف ماصة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي قدر الإمكان. لإعداد مزيج ترانسبوساز Tn5 للحضانة.تمت إضافة ميكرولتر واحد من الترانسبوساز إلى كل 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحضانة transposase. نوصي بتحضير مزيج محلول الترانسبوساز أولا وفقا لعدد التفاعلات. ثم إضافة أليكوت من 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب.تم خلط المحلول بلطف وتركه على شاكر أفقي في درجة حرارة الغرفة في 12 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. تم خلط الأنابيب بلطف كل 10 إلى 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تم غسل النوى ثلاث مرات باستخدام 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل هطول الأمطار المناعي في درجة حرارة الغرفة لإزالة ترانسبوساز Tn5 غير المقيد.بعد الغسيل الثالث ، تم نسج الأنبوب عند 300 rcf لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، وتم استخدام طرف ماصة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي. بالنسبة لخطوة وضع العلامات ، تمت إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للوسم إلى أنبوب التفاعل. تم خلط المحلول جيدا وتحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة ، تمت إضافة 10 ميكرولترات من 0.5 مول لكل لتر EDTA عند 30 ميكرولتر من 10٪ SDS لتحديد التفاعل. تمت إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي. تم إجراء استخراج الحمض النووي غير المنتظم.تم إذابة شظايا الحمض النووي في 25 ميكرولتر من الماء المعقم. تم استخدام 24 ميكرولتر لتضخيم PCR في بناء مكتبة NGS. يوضح هذا الشكل بقعة النوى السليمة مع DAPI في الصورة ، تحت المجهر الحصول على كمية كافية من النوى سليمة ونظيفة نسبيا هي الخطوة الحاسمة ل CUT & Tag.بعد PCR ، تم نقل ميكرولترين وتم فحص حجم الحمض النووي على هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪. يوضح هذا الشكل أنه مقارنة مع التحكم السلبي في جين الغلوبولين المناعي. يجب أن يتراوح الجزء الأكبر من شظايا الحمض النووي من عينة Histone H3 Lysine 4 Trimethylation من 280 إلى 500 زوج قاعدة.يمكن تنقية شظايا الحمض النووي ثم توصيفها عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. يوضح هذا الشكل تسلسل توليد النتائج للجسم المضاد المضاد للهيستون H3 Lysine 4 Trimethylation مقارنة مع مجموعات التحكم السلبية في الغلوبولين المناعي G. تقوم هذه التقنية بإنشاء مكتبات الحمض النووي بدقة عالية وخلفية منخفضة بشكل استثنائي باستخدام عدد صغير من الخلايا مع إجراء مبسط مقارنة ب ChIP-seq.CUT & Tag هي طريقة جديدة ولا تزال قيد التقدم.