Detta arbete stöddes delvis ekonomiskt av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) och fundamentala forskningsfonder för de centrala universiteten, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) och JCIC-MCP-projektet.

1. Förbered transposas- och lagerlösningar (dag 1)
OBS: I den här delen är oligonukleotidadaptrarna komplexa med Tn5-transponat för att göra aktiv transposas.
<ol><li>Späd primers (primer A, primer B och primer C) till 100 μM koncentration med hjälp av glödgningsbufferten (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (se tabell 1 för sekvensinformation om primers och tabell 2 för recept för arbetslösningar). Förvara vid -20 °C t...

<ol>
	<li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+ENCODE.">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT&amp;Tag.">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&amp;Tag.</a> Plant Methods. 16, 120 (2020).</li><li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT&amp;Tag.">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&amp;Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li><li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+CUT&amp;Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues.">Single-cell CUT&amp;Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li><li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+(Gossypium+spp.)+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis.">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).</li><li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT&amp;Tag.">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&amp;Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).</li><li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks.">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li></ol>

Här har vi beskrivit CUT&Tag, en teknik för att generera DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande jämfört med kromatinimprecipitering (ChIP). Vår framgång med H3K4me3-profilering i bomullsblad tyder på att CUT&Tag, som först designades för djurceller, också kan användas för växtceller. Både Tris buffertsystem som vanligen används för ChIP-analys8 och HEPES-buffertsystemet som används för animal CUT&Tag-arbete f...

Transkriptionsfaktorbindande DNA-platser och öppet kromatin i samband med histonmodifieringsmärken fyller kritiska funktionella roller för att reglera genuttryck och är de viktigaste fokusen för epigenetisk forskning1. Konventionellt har kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) i kombination med djup sekvensering (ChIP-seq) använts för genomomfattande identifiering av specifika kromatin histon modifiering eller DNA-mål med specifika proteiner, och är allmänt antagen inom området epigenetik2. Klyvning under mål och tagningsteknik (CUT&Tag) utvecklades ursprungligen av Henikoff Lab för att fånga de proteinanslutna DNA-fragmenten i hela genomet5. Jämfört med ChIP genererar CUT&Tagcan DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande3. Hittills har metoder för analys av kromatinregioner med specifika histonmodifieringar med CUT&Tag fastställts i djurceller4,5. Specifikt har encelliga CUT&Tag (scCUT&Tag) också framgångsrikt utvecklats för mänskliga vävnader och celler6. Men på grund av cellväggens och sekundära metaboliters komplexitet är CUT&Tag fortfarande tekniskt utmanande för växtvävnader.
Tidigare rapporterade vi ett CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allotetraploid bomullsblad4. För att demonstrera effektiviteten av atomisolering och DNA-fångst med hjälp av växtvävnad presenteras profileringsförfarandet här. De viktigaste stegen inkluderar intakt atomkärnor isolering, in situ inkubation med antikroppen för kromatin modifiering, transposase inkubation, adapter integration, och DNA bibliotek förberedelse. Felsökningen fokuserar på CUT&Tag-bibliotekets förberedelse för isolering av växtkärnor och kvalitetskontroll. 
I denna studie presenterar vi en förfinad CUT&Tag-strategi för växter. Vi tillhandahåller inte bara ett steg-för-steg-protokoll för H3K4me3-profilering i bomullsblad, utan vi tillhandahåller också en optimerad metodik för isolering av växtkärnor, inklusive strategin för att välja koncentrationen av tvättmedel för korrekt celllys och strategin att filtrera kärnorna. Detaljerade steg med kritiska kommentarer ingår också i det här uppdaterade protokollet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K4me3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digitonin (~50% (TLC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td>Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M MgCl2 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539133-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M KCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 5 M NaCl stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermidine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 2 M spermidine stock solution, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make 20% Triton X-100 stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&#38;Tag</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>S602/S603</td>
			<td>Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruePrep Amplify Enzyme</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TD601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>HS-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One&#160; spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of h3k4me3 modification in plants using cleavage under targets and tagmentation

Epigenomisk reglering på kromatisk nivå, inklusive DNA och histon modifieringar, beteenden av transkriptionsfaktorer och icke-kodande RNAs med sina rekryterade proteiner, leder till temporal och rumslig kontroll av genuttryck. Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en enzym-tethering metod där det specifika kromatinproteinet först känns igen av sin specifika antikropp, och sedan antikroppen binder ett protein A-transponas (pA-Tn5) fusionsprotein, som klyver det riktade kromatinet in situ genom aktivering av magnesiumjoner. Här tillhandahåller vi vårt tidigare publicerade CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allortetraploid bomullsblad med modifiering. Detta steg-för-steg-protokoll kan användas för epigenomisk forskning i växter. Dessutom är betydande ändringar för isolering av växtkärnor kritiska kommentarer.

Bild 1 visar ARBETSFLÖDET CUT&Tag. Figur 2 visar DAPI-färgningen av de intakta kärnorna. Målet med "nuklei isolering" steget var att få intakta kärnor på en tillräcklig mängd för den efterföljande CUT&Tag reaktionen. Figur 3 visar agarosegelelektrofores av PCR-produkter. Den negativa IgG-kontrollen krävs parallellt när experimentet ställs in. Jämfört med IgG-kontrollgruppen varierade huvuddelen av DNA-fragmenten som ...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation at JoVE.com

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Detta protokoll presenterar en förfinad CUT&Tag-strategi för profilering av histonmodifieringar i växter.

Profilering av H3K4me3 Modifiering i växter som använder klyvning under mål och tagning

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Det övergripande målet med experimentet var att identifiera proteinanslutna DNA-fragment i hela genomet, vilket återspeglade kromatinets status. För att uppnå detta mål utfördes tre specialoperationer. Först och främst isolerades de intakta kärnorna från växtceller.För det andra erkändes modifieringar av kromatin av en specifik antikropp in situ. För det tredje, antikroppen som binder ett protein A-transpons fusionsprotein, Tn5 transposas, klyva kromatin in situ under aktivering av magnesiumjoner. DNA-fragmenten och kromatinmodifieringsbindningsplatserna integrerades sedan med adaptrar och gjordes redo för DNA-beredning.Polymeraskedjereaktionsberikning förbättrad generationssekvensering. Epigenomik reglering på kromatisk nivå, inklusive DNA och histon modifieringar, beteenden av transkription faktorer och icke-kodning RNAs med sina rekryterade proteiner, leder till tidsmässig och rumslig kontroll av genuttryck. CUT&Tag-teknik utvecklad av Henikoff Lab är en enzymtjuderingsmetod för kromatin epigenomikprofilering med hög effektivitet.Här använder vi bomullsbladen som experimentella material, och för att utföra kromatinprofilering med antikroppar från Histone H3 Lysine-4 Trimetylation som ett exempel. Vi tillhandahåller ett förfinat protokoll med video för CUT&Tag prestanda i växter. För varje provberedning med CUT&Tag samlades gram bomullsbladsvävnad in.Bladet maldes till ett fint pulver med flytande kväve och överfördes till ett 50 ml falkrör som innehöll 25 ml kyld kärnisoleringsbuffert A.Buffertlösningen blandades försiktigt och röret inkuberades på is i fem minuter med mild skakning för att fördela materialet jämnt. Det snurrades sedan vid 500 relativa centrifugalkraft eller rcf, vid 4 grader Celsius, i fem minuter, för att bilda cellpelleten. Supernatanten dekanterades och pelleten återanvänds med 20 ml kyld kärnisoleringsbuffert B, kompletterad med 0,5%Triton.Röret inverterades försiktigt för att återanvända pelleten helt. Den resulterande cell lysate filtrerades sedan med en kombination av två siktar, en 500-mesh sil användes ovanpå för att ta bort de större vävnadsresterna. Och en sikt med 1000 maskor användes på botten för att samla in kärnorna.Valet av lämplig maskstorlek på siktarna beror på storleken på växternas kärnor. Sterilt filterpapper användes på baksidan av sikten för att absorbera en del av lysat och små cellrester. Lysat som innehåller kärnorna överfördes till ett färskt 1,5 milliliter centrifugrör och snurrades vid 300 rcf i fyra minuter, vid 4 grader Celsius grader Celsius för att samla kärnorna.Efter centrifugering användes en pipettspets för att ta bort så mycket av supernatanten som möjligt. En mängd av 800 mikroliter, en kärntvättbuffert tillsattes. Och röret inverterades försiktigt för att återanvända atomkärnorna.Röret snurrades igen vid 300 rcf, i fyra minuter vid 4 grader Celsius. Efter totalt tre tvättar kombinerades de resulterande kärnorna i ett färskt 1,5 milliliter centrifugrör och snurrades vid 300 rcf i fyra minuter vid 4 grader Celsius. En pipettspets användes för att ta bort så mycket den återstående bufferten som möjligt.Nästa steg var inkubationen av antikroppen. En alikvot på 50 mikroliter av atomkärnor återanvändes i 1 milliliter antikroppsbuffert kompletterad med EDTA, BSA, proteashämmande cocktail i digitonin. En alikvot på 150 mikroliter av nuklei suspension placerades i en färsk 1,5 milliliter rör för en reaktion, två mikroliter av antikroppar lades till varje rör.I denna analys inrättades två biologiska replikat för anti-histon-H3-Lysin-4-Trimetylation antikropp och immunoglobulin G negativa kontrollgrupper efter antikroppen tillsattes. Lösningen blandades försiktigt, och rören lämnades på en horisontell shaker för hybridisering över natten vid fyra grader Celsius i 12 rpm. Nästa morgon togs rören ut och kärnorna tvättades med hjälp av 800 mikroliter av immun nederbörd tvätt buffert.Röret inverterades försiktigt för blandning och det lämnades på horisontell skakapparat i fem minuter vid rumstemperatur i 12 rpm. Efter tvätt snurrades röret vid 300 rcf i fyra minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering avlägsnades supernatanten med hjälp av en pipettspets.Detta upprepades för totalt tre tvättar. Efter den tredje tvätten snurrades röret en 300 rcf i två minuter vid fyra grader Celsius, och en pipettspets användes för att ta bort den återstående bufferten så mycket som möjligt. För att förbereda Tn5 transposasblandningen för inkubation.En mikroliter transponering lades till varje 150 mikroliter av transposasinkubationsbufferten. Vi rekommenderar att du först förbereder blandningen av transposaslösning beroende på antalet reaktioner. Och sedan lägga till en alikvot på 150 mikroliter till varje rör.Lösningen blandades försiktigt och lämnades på en horisontell skakapparat vid rumstemperatur i 12 rpm i två timmar. Rören blandades försiktigt var 10 till 15 minuter. Efter inkubation tvättades atomkärnorna tre gånger med 800 mikroliter av immun nederbörd tvättbuffert vid rumstemperatur för att ta bort den obundna Tn5 transposase.Efter den tredje tvätten snurrades röret vid 300 rcf i två minuter vid fyra grader Celsius, och en pipettspets användes för att ta bort den återstående bufferten. För tagmentationssteget lades 300 mikroliter taggmentationsbuffert till reaktionsröret. Lösningen blandades väl och inkuberades vid 37 grader Celsius i en timme.Efter inkubation tillkom 10 mikroliter av 0,5 mol per liter EDTA vid 30 mikroliter av 10%SDS för att bestämma reaktionen. Nästa 300 mikroliter av DNA-extraktion buffert lades till. Oregelbunden DNA-extraktion utfördes.DNA-fragment upplöstes i 25 mikroliter sterilt vatten. 24 mikroliter användes för PCR förstärkning i NGS bibliotek konstruktion. Denna figur visar den intakta kärnor fläcken med DAPI i bilden, under ett mikroskop som får en tillräcklig mängd intakta och relativt rena kärnor är det kritiska steget för CUT&Tag.Efter PCR överfördes två mikroliter och storleken på DNA kontrollerades på 1,5%agarose gel. Denna siffra visar att jämföra med immunoglobulin genen negativ kontroll. Huvuddelen av DNA-fragmenten från Histone H3 Lysine 4 Trimetylationsprovet bör variera från 280 till 500 baspar.DNA-fragmenten kan renas och sedan profileras genom hög genomströmningssekvensering. Denna siffra visar resultaten generation sekvensering för anti-histon H3 Lysine 4 Trimetylation antikropp jämför med immunoglobulin G negativa kontrollgrupper. Denna teknik genererar DNA-biblioteken med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med en förenklad procedur jämfört med ChIP-seq.CUT&Tag är en ny metod som fortfarande pågår.