Abstract
Biochemistry
Ribosome-profileringsteknikken (RIBO-seq) er i øjeblikket det mest effektive værktøj til at studere processen med proteinsyntese in vivo. Fordelen ved denne metode, i forhold til andre tilgange, er dens evne til at overvåge oversættelse ved præcist at kortlægge placeringen og antallet af ribosomer på en mRNA-udskrift.
I denne artikel beskriver vi de efterfølgende stadier af prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq-metoden i bakterier og fremhæver de detaljer, der er relevante for planlægningen og udførelsen af eksperimentet.
Da RIBO-seq er afhængig af intakte ribosomer og relaterede mRNA'er, er det vigtigste trin hurtig hæmning af oversættelse og tilstrækkelig opløsning af celler. Således foreslår vi filtrering og flash-frysning i flydende nitrogen til cellehøst med en valgfri forbehandling med chloramphenicol for at arrestere oversættelse i bakterier. Til opløsning foreslår vi slibning af frosne celler med mørtel og støder i nærværelse af aluminiumoxid for mekanisk at forstyrre cellevæggen. I denne protokol kræves der ikke saccharosepude eller en saccharosegradient ultracentrifugering til monosomerensning. I stedet anvendes mRNA-adskillelse ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af ribosomal fodaftryk excision (28-30 nt bånd) og giver tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i vid udstrækning metoden samt reducerer tids- og udstyrskravene til proceduren. Til biblioteksforberedelse anbefaler vi at bruge det kommercielt tilgængelige lille RNA-sæt til Illumina-sekventering fra New England Biolabs efter producentens retningslinjer med en vis grad af optimering.
De resulterende cDNA-biblioteker præsenterer passende mængde og kvalitet, der kræves til næste generations sekventering (NGS). Sekvensering af biblioteker udarbejdet i henhold til den beskrevne protokol resulterer i 2 til 10 mln entydigt kortlagt læser per prøve giver tilstrækkelige data til omfattende bioinformatik analyse. Den protokol, vi præsenterer, er hurtig og relativt nem og kan udføres med standardlaboratorieudstyr.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved