RIBO-seq i bakterier: en prøvesamling og biblioteksforberedelsesprotokol til NGS-sekventering

Ribosome-profileringsteknikken (RIBO-seq) er i øjeblikket det mest effektive værktøj til at studere processen med proteinsyntese in vivo. Fordelen ved denne metode, i forhold til andre tilgange, er dens evne til at overvåge oversættelse ved præcist at kortlægge placeringen og antallet af ribosomer på en mRNA-udskrift.

I denne artikel beskriver vi de efterfølgende stadier af prøveindsamling og forberedelse til RIBO-seq-metoden i bakterier og fremhæver de detaljer, der er relevante for planlægningen og udførelsen af eksperimentet.

Da RIBO-seq er afhængig af intakte ribosomer og relaterede mRNA'er, er det vigtigste trin hurtig hæmning af oversættelse og tilstrækkelig opløsning af celler. Således foreslår vi filtrering og flash-frysning i flydende nitrogen til cellehøst med en valgfri forbehandling med chloramphenicol for at arrestere oversættelse i bakterier. Til opløsning foreslår vi slibning af frosne celler med mørtel og støder i nærværelse af aluminiumoxid for mekanisk at forstyrre cellevæggen. I denne protokol kræves der ikke saccharosepude eller en saccharosegradient ultracentrifugering til monosomerensning. I stedet anvendes mRNA-adskillelse ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) efterfulgt af ribosomal fodaftryk excision (28-30 nt bånd) og giver tilfredsstillende resultater. Dette forenkler i vid udstrækning metoden samt reducerer tids- og udstyrskravene til proceduren. Til biblioteksforberedelse anbefaler vi at bruge det kommercielt tilgængelige lille RNA-sæt til Illumina-sekventering fra New England Biolabs efter producentens retningslinjer med en vis grad af optimering.

De resulterende cDNA-biblioteker præsenterer passende mængde og kvalitet, der kræves til næste generations sekventering (NGS). Sekvensering af biblioteker udarbejdet i henhold til den beskrevne protokol resulterer i 2 til 10 mln entydigt kortlagt læser per prøve giver tilstrækkelige data til omfattende bioinformatik analyse. Den protokol, vi præsenterer, er hurtig og relativt nem og kan udføres med standardlaboratorieudstyr.