RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Die Ribosomenprofilierungstechnik (RIBO-seq) ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zuuntersuchen. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Ansätzen ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen auf einem mRNA-Transkript genau abgebildet wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die aufeinanderfolgenden Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für die RIBO-seq-Methode bei Bakterien und heben die Details hervor, die für die Planung und Durchführung des Experiments relevant sind.

Da das RIBO-seq auf intakte Ribosomen und verwandte mRNAs angewiesen ist, ist der Schlüsselschritt eine schnelle Hemmung der Translation und ein adäquater Zerfall der Zellen. Daher empfehlen wir die Filtration und das Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff für die Zellernte mit einer optionalen Vorbehandlung mit Chloramphenicol, um die Translation in Bakterien zu unterbrechen. Für den Zerfall schlagen wir vor, gefrorene Zellen mit Mörtel und Stößel in Gegenwart von Aluminiumoxid zu mahlen, um die Zellwand mechanisch zu stören. In diesem Protokoll ist kein Saccharosekissen oder eine Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation zur Monosomenreinigung erforderlich. Stattdessen wird die mRNA-Trennung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gefolgt von der ribosomalen Fußabdruckexzision (28-30 nt-Band) angewendet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Dies vereinfacht die Methode weitgehend und reduziert den Zeit- und Geräteaufwand für das Verfahren. Für die Bibliotheksvorbereitung empfehlen wir die Verwendung des kommerziell erhältlichen kleinen RNA-Kits für die Illumina-Sequenzierung von New England Biolabs, das den Richtlinien des Herstellers mit einem gewissen Grad an Optimierung folgt.

Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für Next Generation Sequencing (NGS) erforderlich ist. Die Sequenzierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken führt zu 2 bis 10 Mio. eindeutig abgebildeten Lesevorgängen pro Probe, die ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse liefern. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist schnell und relativ einfach und kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden.