बैक्टीरिया में RIBO-seq: NGS अनुक्रमण के लिए एक नमूना संग्रह और पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल

राइबोसोम प्रोफाइलिंग तकनीक (RIBO-seq) वर्तमान में वीवो मेंप्रोटीन संश्लेषण की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सबसे प्रभावी उपकरण है। इस विधि का लाभ, अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में, एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स की स्थिति और संख्या को ठीक से मैप करके अनुवाद की निगरानी करने की क्षमता है।

इस लेख में, हम नमूना संग्रह के लगातार चरणों और बैक्टीरिया में RIBO-seq विधि के लिए तैयारी का वर्णन करते हैं, जो प्रयोग की योजना और निष्पादन के लिए प्रासंगिक विवरणों को उजागर करते हैं।

चूंकि RIBO-seq बरकरार राइबोसोम्स और संबंधित mRNAs पर निर्भर करता है, महत्वपूर्ण कदम अनुवाद और कोशिकाओं के पर्याप्त विघटन के तेजी से अवरोध है । इस प्रकार, हम बैक्टीरिया में अनुवाद को रोकने के लिए क्लोरम्फेनिकोल के साथ एक वैकल्पिक पूर्वउपचार के साथ सेल हार्वेस्टिंग के लिए तरल नाइट्रोजन में छानने और फ्लैश-फ्रीजिंग का सुझाव देते हैं। विघटन के लिए, हम यांत्रिक रूप से सेल की दीवार को बाधित करने के लिए एल्यूमीनियम ऑक्साइड की उपस्थिति में मोर्टार और मूसल के साथ जमे हुए कोशिकाओं को पीसने का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मोनोसोम शुद्धिकरण के लिए सुक्रोज कुशन या सुक्रोज रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, पॉलीएक्रीलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) का उपयोग करके एमआरएनए सेपरेशन लागू किया जाता है और इसके बाद राइबोसोमल पदचिह्न एक्ससेशन (28-30 एनटी बैंड) लागू होता है और संतोषजनक परिणाम प्रदान करता है। यह काफी हद तक विधि को सरल बनाता है और साथ ही प्रक्रिया के लिए समय और उपकरण आवश्यकताओं को कम करता है। पुस्तकालय की तैयारी के लिए, हम कुछ हद तक अनुकूलन के साथ निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स से इलुमिना अनुक्रमण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे आरएनए किट का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

परिणामस्वरूप सीडीएनए पुस्तकालयों उचित मात्रा और अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) के लिए आवश्यक गुणवत्ता मौजूद हैं । 2 से 10 एमएलएन विशिष्ट रूप से मैप किए गए नमूने में वर्णित प्रोटोकॉल परिणामों के अनुसार तैयार पुस्तकालयों की अनुक्रमण व्यापक जैव सूचनात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान करने वाले प्रति नमूने को पढ़ता है। प्रोटोकॉल हम मौजूद है जल्दी और अपेक्षाकृत आसान है और मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है ।