用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备

Summary

鞘脂是生物活性代谢物，在人类疾病中具有公认的作用。用质谱法表征组织改变可以揭示疾病病因学中的作用或确定治疗靶点。然而，用于生物储存库中冷冻保存的OCT化合物会干扰质谱分析。我们概述了使用LC-ESI-MS / MS分析嵌入OCT的人体组织中鞘脂的方法。

Abstract

鞘脂是在人体新陈代谢和疾病中具有明确作用的细胞成分。质谱可用于确定鞘脂在疾病中是否改变，并研究鞘脂是否可以在临床上靶向。然而，直接从手术室获取组织的适当把握度的前瞻性研究可能非常耗时，并且在技术、后勤和行政上具有挑战性。相比之下，回顾性研究可以利用组织生物储存库中已经存在的冷冻保存的人类标本，通常数量很大。从生物储存库采购组织的其他优点包括访问与组织标本相关的信息，包括组织学、病理学以及在某些情况下的临床病理学变量，所有这些都可用于检查与脂质组学数据的相关性。然而，与冷冻保存和质谱中使用的最佳切割温度化合物（OCT）不相容相关的技术限制是脂质分析的技术障碍。然而，我们之前已经证明，OCT可以通过洗涤和离心的循环轻松地从人类生物储存库标本中去除，而不会改变其鞘脂含量。我们之前还确定，在OCT中冷冻保存的人体组织中的鞘脂可以稳定长达16年。在本报告中，我们概述了分析嵌入OCT的人组织标本中鞘脂的步骤和工作流程，包括洗涤组织，称量组织以进行数据归一化，脂质提取，制备用于液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）分析的样品，质谱数据集成，数据归一化和数据分析。

Introduction

鞘脂是生物活性代谢物，以其在人体代谢^{和疾病中的作用}而闻名1^，2。它们调节复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活和死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭和转移、血管生成以及细胞因子的产生¹，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.鞘脂代谢调节的缺陷有助于癌症的发生和进展，决定癌症的侵袭性，以及癌症如何^{对治疗产生}反应和耐药性3^，10。因此，由于这些对疾病病因的广泛影响，能够精确确定疾病特异性鞘脂改变的分析方法是重要的工具。质谱（MS）是分析鞘脂改变的最准确和可靠的方法。

Protocol

根据内部审查委员会（IRB）批准的协议（#HM2471），从弗吉尼亚联邦大学（VCU）组织和数据采集和分析核心获得去识别的人肺组织。使用小鼠研究和收获小鼠组织得到了VCU机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 材料准备

注意：这些步骤应在纸巾清洗前一天进行。

1. 对 1.5 mL 聚丙烯离心管进行预标记和称量，并为第二天处理的每个样品提供简?.......

Discussion

OCT是一种常见的长期冷冻保存剂，用于生物储存库。然而^，当通过各种质谱平台^{12、13、14、15}分析组织时，OCT会导致离子抑制，或者当通过LC-ESI-MS/MS¹¹分析样品时，会导致信号丢失。冷冻保存组织中的OCT也会干扰组织标准化方法，例如称量和蛋白质定量测定，例如Bradford和BCA

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL polypropylene pipette tips	NA	NA	Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer flask	VWR	89091-116	Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550	For LC mobile phases
Analytical scale	NA	NA	Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser	Sartorius	LH-723071	Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven	Shimadzu	NA	For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	Internal standard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm screw top tubes
Heated water bath	NA	NA	For overnight lipid extraction
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe	Fisher Scientific	15-340-177	for homogenization
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system	Shimadzu	NA	For LC-MS
Permanent marker	VWR	52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)	VWR	89001-502	13x100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline	Thermo Scientific	10010023	To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette	Eppendorf	4987000118	To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone	VWR	89239-020	Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch	VWR	46610-724	Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column	Sigma Aldrich	53822-U	For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath	Branson	Model 2800	for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer	NA	NA	For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass	VWR	47729572	13x100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400