Abstract
Biology
Undersøgelsen af DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essentielt felt, som kun er blevet vigtigere på grund af brugen af DDR-målrettede lægemidler til kræftbehandling. Disse mål er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARP'er), som initierer forskellige former for DNA-reparation. Hæmning af disse enzymer ved hjælp af PARP-hæmmere (PARPi) opnår syntetisk dødelighed ved at give en terapeutisk sårbarhed i homologe rekombinationsceller (HR)-mangelfulde celler på grund af mutationer i brystkræft type 1 (BRCA1), BRCA2 eller partner og lokalisator af BRCA2 (PALB2).
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er). Disse brud behandles af DNA-enderesektionsmaskineriet, hvilket fører til dannelsen af enkeltstrenget (ss) DNA og efterfølgende DNA-reparation. I en BRCA1-mangelfuld sammenhæng forårsager genoplivning af DNA-resektion gennem mutationer i DNA-resektionshæmmere, såsom 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det afgørende at kunne overvåge DNA-resektion i cellulo for en klarere forståelse af DNA-reparationsvejene og udviklingen af nye strategier til at overvinde PARPi-resistens. Immunofluorescens (IF)-baserede teknikker muliggør overvågning af global DNA-resektion efter DNA-skade. Denne strategi kræver genomisk DNA-mærkning med lang puls med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU). Efter DNA-skade og DNA-enderesektion påvises det resulterende enkeltstrengede DNA specifikt af et anti-BrdU-antistof under indfødte forhold. Desuden kan DNA-resektion også undersøges ved hjælp af cellecyklusmarkører for at skelne mellem forskellige faser af cellecyklussen. Celler i S/G2-fasen tillader undersøgelse af enderesektion inden for HR, mens G1-celler kan bruges til at studere ikke-homolog slutslutning (NHEJ). En detaljeret protokol for denne IF-metode koblet til cellecyklusdiskrimination er beskrevet i dette papir.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved