הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

המחקר של תגובת נזק ה- DNA (DDR) הוא תחום מורכב וחיוני, אשר רק הפך חשוב יותר בשל השימוש בתרופות ממוקדות DDR לטיפול בסרטן. מטרות אלה הן פולי (ADP-ריבוז) פולימראזים (PARPs), אשר יוזמים צורות שונות של תיקון DNA. עיכוב אנזימים אלה באמצעות מעכבי PARP (PARPi) משיג קטלניות סינתטית על ידי מתן פגיעות טיפולית בתאים רקומבינציה הומולוגית (HR) לקוי עקב מוטציות בסוג סרטן השד 1 (BRCA1), BRCA2, או שותף ולוקליזר של BRCA2 (PALB2).

תאים שטופלו ב- PARPi צוברים הפסקות דנ"א כפולות גדילים (DSB). הפסקות אלה מעובדות על ידי מכונות כריתת קצה ה- DNA, מה שמוביל להיווצרות DNA חד-גדילי (ss) ותיקון DNA לאחר מכן. בהקשר של מחסור ב-BRCA1, כריתת דנ"א מחודשת באמצעות מוטציות במעכבי כריתת דנ"א, כגון 53BP1 ו-DYNLL1, גורמת להתנגדות PARPi. לכן, היכולת לפקח על כריתת DNA בצלולו היא קריטית להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על התנגדות PARPi. טכניקות מבוססות אימונופלואורסצנטיות (IF) מאפשרות ניטור של כריתת דנ"א גלובלית לאחר נזק לדנ"א. אסטרטגיה זו דורשת תיוג דנ"א גנומי בעל דופק ארוך עם 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU). בעקבות נזק לדנ"א וחיתוך קצה דנ"א, הדנ"א החד-גדילי שנוצר מזוהה במיוחד על ידי נוגדן אנטי-BrdU בתנאים מקומיים. יתר על כן, כריתת DNA ניתן גם ללמוד באמצעות סמני מחזור התא כדי להבדיל בין שלבים שונים של מחזור התא. תאים בשלב S/G2 מאפשרים את חקר כריתת הקצה בתוך משאבי אנוש, בעוד שתאי G1 יכולים לשמש לחקר צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ). פרוטוקול מפורט עבור שיטת IF זו בשילוב עם אפליית מחזור תאים מתואר במאמר זה.