الكشف عن تجميع البروتين باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري

Summary

نحن هنا نقدم إجراء لقياس أوليغومر البروتين والتجميع في الخلايا lysate والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي ارتباط مضان.

Abstract

تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD) وما إلى ذلك. للكشف عن وتحليل أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان أو المنتشرة أو المجاميع ، تم استخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يمكنه اكتشاف سرعة الانتشار وسطوع جسيم واحد مع حساسية جزيء واحد. ومع ذلك، لم يتم تقاسم الإجراءات والدراية المناسبة للكشف عن تجميع البروتين على نطاق واسع. هنا ، نعرض إجراء قياسيا لقياس FCS لخصائص الانتشار للبروتينات المعرضة للتراكم في lysate الخلية والخلايا الحية: ALS المرتبطة 25 kDa carboxyl-terminal جزء من TAR DNA / الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 43 كيلودا (TDP25) وdismutase أكسيد 1 (SOD1). تظهر النتائج التمثيلية أن جزءا من مجاميع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم TDP25 تم تضمينه قليلا في الكسر القابل للذوبان من تحلل خلية الورم الأرومي العصبي المورفين Neuro2a. وعلاوة على ذلك ، GFP الموسومة SOD1 تحمل الطفرة المرتبطة ALS يظهر انتشار أبطأ في الخلايا الحية. وبناء على ذلك، نحن هنا نقدم الإجراء للكشف عن تجميع البروتين عن طريق خاصية نشرها باستخدام FCS.

Introduction

تجمعات البروتين التي تنطوي على اضطرابات عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, وهلم جرا¹ ومن المعروف أن تكون سامة ومن شأنها أن تزعج التوازن البروتين (البروتيوستاسي) في الخلايا والأعضاء, التي يمكن أن تؤدي بعد ذلك إلى الشيخوخة². ومن المتوقع إزالة البروتين تجميع كاستراتيجية علاجية; ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد المواد الكيميائية التي تمنع تكوين البروتين وتتحلل مجاميع البروتين (مثل الجزيئات الصغيرة أو الأدوية). وعلاوة على ذلك، فإن كيفية ممارسة تجميع البروتين للسمية لا تزال بعيدة المنال. لذلك ، لتعزيز المشاريع البحثية المتعلقة بتجميع البروتين ، من المهم إدخال إجراءات عالية الإنتاجية للكش....

Protocol

1. المواد والكواشف

1. استخدام الحلول الحرة بيراموجينيك والمتوسطة لثقافة الخلية (الجدول 1).
2. إعداد حلول للتجربة الكيميائية الحيوية باستخدام المياه فائقة الشراء واستخدامها كما DNase / RNase الحرة.
3. حدد FBS مناسبة لثقافة الخلية مع عملية الاختيار الكثير. وبما أن مجموعة FBS المحددة.......

Discussion

وفيما يتعلق بمعايرة النظام قبل القياسات، ينبغي استخدام نفس الأواني الزجاجية المستخدمة لقياس العينة (على سبيل المثال، تغطي الآبار الثمانية الحجرة الزجاجية لليسات الخلية وطبق الأساس الزجاجي للخلايا الحية مقاس 35 ملم). بسبب الامتزاز من Rh6G على الزجاج، قد ينخفض تركيزها الفعال في بعض الأحيان. ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304