Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi

Summary

Vi introducerer her en procedure til måling af protein oligomerer og sammenlægning i celle lysat og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi.

Abstract

Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons Sygdom (HS) osv. For at detektere og analysere opløselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater er der anvendt fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektere diffusionshastigheden og lysstyrken af en enkelt partikel med en enkelt molekylefølsomhed. Den korrekte procedure og knowhow til registrering af proteinsammenlægning er imidlertid ikke blevet udbredt. Her viser vi en standardprocedure for FCS-måling for diffusionsegenskaber af aggregerings-tilbøjelige proteiner i celle lysat og levende celler: ALS-associeret 25 kDa carboxyl-terminalfragment af TAR DNA/ RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoxid dismutase 1 (SOD1). De repræsentative resultater viser, at en del af aggregaterne af grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket TDP25 var lidt inkluderet i den opløselige fraktion af murine neuroblastoma Neuro2a celle lysat. Desuden viser GFP-mærket SOD1 med ALS-associeret mutation en langsommere diffusion i levende celler. Derfor introducerer vi her proceduren til påvisning af proteinsammenlægningen via dens diffusionsegenskab ved hjælp af FCS.

Introduction

Proteinsammenlægninger, der involverer neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom og så videre¹ er kendt for at være giftige og ville forstyrre proteinhomostase (proteostase) i celler og organer, som derefter kan føre til^{aldring 2}. Rydning af proteinsammenlægning forventes som en terapeutisk strategi; Der er dog endnu ikke etableret kemikalier, der forhindrer dannelse af proteinsammenlægning og nedbryder proteinaggregater (f.eks. små molekyler eller lægemidler). Desuden er det stadig vanskeligt at finde ud af, hvordan proteinsammenlægning ud....

Protocol

1. Materialer og reagenser

1. Brug pyrogene frie opløsninger og medium til cellekultur(tabel 1).
2. Forbered løsninger til det biokemiske eksperiment ved hjælp af ultrapure vand og brug som DNase / RNase gratis.
3. Vælg en passende FBS til cellekulturen med en lotkontrolproces. Da det valgte FBS-parti ændres regelmæssigt, kan kataloget og lotnummeret for FBS ikke repræsenteres her.
4. Plasmid DNA
   1. Forbered pmeGFP-N1⁵ til monomert eGFP-udtr.......

Discussion

Med hensyn til systemkalibrering før målinger bør der anvendes de samme glasvarer som det, der anvendes til måling af prøven (f.eks. skal glaskammeret med 8 brønde til cellelysat og 35 mm glasbasisretten til levende celler anvendes). På grund af adsorptionen af Rh6G på glasset kan dens effektive koncentration undertiden falde. Hvis det er tilfældet, bør en stærkt koncentreret Rh6G-opløsning som 1 μM kun anvendes til justering af pinhole. Ekstremt høje antal fotonhastigheder skal undgås for at beskytte dete.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304