Détection de l’agrégation protéique à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence

Summary

Nous introduisons ici une procédure pour mesurer les oligomers protéiques et l’agrégation dans les cellules lysées cellulaires et vivantes à l’aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Abstract

L’agrégation protéique est une caractéristique des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington (MH), et ainsi de suite. Pour détecter et analyser les oligomers ou agrégats protéiques solubles ou diffus, la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), qui peut détecter la vitesse de diffusion et la luminosité d’une seule particule avec une seule sensibilité molécule, a été utilisée. Cependant, la procédure et le savoir-faire appropriés pour la détection de l’agrégation des protéines n’ont pas été largement partagés. Ici, nous montrons une procédure standard de mesure fcs pour les propriétés de diffusion des protéines sujettes à l’agrégation dans le lysate cellulaire et les cellules vivantes : fragment carboxyl-terminal associé à la SLA de l’ADN TAR/protéine liant l’ARN 43 kDa (TDP25) et de la dismutase de superoxyde 1 (SOD1). Les résultats représentatifs montrent qu’une partie des agrégats de protéine fluorescente verte (GFP) marqué TDP25 a été légèrement inclus dans la fraction soluble du lysate cellulaire neuroblastome murin Neuro2a. En outre, le SOD1 marqué GFP portant la mutation ALS-associée montre une diffusion plus lente dans les cellules vivantes. En conséquence, nous introduisons ici la procédure de détection de l’agrégation protéique via sa propriété de diffusion à l’aide de FCS.

Introduction

Les agrégations protéiques impliquant des troubles neurodégénératifs tels que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington, et^{ainsi de suite, sont} connues pour être toxiques et perturberaient l’homéostasie protéique (protéostasie) dans les cellules et les organes, qui pourrait alors conduire au vieillissement². Le dégagement de l’agrégation protéique est attendu comme stratégie thérapeutique; toutefois, les produits chimiques qui empêchent la formation d’agrégations protéiques et dégradent les agrégats protéiques (p. ex., petites molécules ou médicame....

Protocol

1. Matériaux et reagents

1. Utilisez des solutions pyrogéniques gratuites et moyennes pour la culture cellulaire( tableau 1).
2. Préparez des solutions pour l’expérience biochimique en utilisant de l’eau ultrapure et utilisez-la sans DNase/RNase.
3. Sélectionnez un FBS approprié pour la culture cellulaire avec un processus de vérification de lot. Étant donné que le lot FBS sélectionné change régulièrement, le catalogue et le numéro de lot de FBS ne peuvent pas être.......

Discussion

En ce qui concerne l’étalonnage du système avant les mesures, les mêmes verreries que celle utilisée pour mesurer l’échantillon devraient être utilisées (p. ex., les 8 puits couvrent la chambre de verre pour le lysate cellulaire et le plat de base en verre de 35 mm pour les cellules vivantes). En raison de l’adsorption de Rh6G sur le verre, sa concentration effective peut parfois diminuer. Si c’est le cas, une solution Rh6G hautement concentrée comme 1 μM doit être utilisée juste pour le réglage du st.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304