फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना

Summary

हम यहां फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिका ओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन ओलिगोमर और एकत्रीकरण को मापने के लिए एक प्रक्रिया शुरू करते हैं।

Abstract

प्रोटीन एकत्रीकरण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग (एचडी) आदि की एक बानगी है। घुलनशील या फैलाना प्रोटीन ओलिगोमर या समुच्चय का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), जो एक ही अणु संवेदनशीलता के साथ एक कण की प्रसार गति और चमक का पता लगा सकता है, का उपयोग किया गया है। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए उचित प्रक्रिया और जानकारी व्यापक रूप से साझा नहीं किया गया है । यहां, हम सेल लिसेट और लाइव कोशिकाओं में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के प्रसार गुणों के लिए एफसीएस माप की एक मानक प्रक्रिया दिखाते हैं: एएलएस-संबद्ध 25 केडीए कार्बोक्सिल-टार डीएनए/आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन 43 केडीए (टीडीपी 25) और सुपरऑक्साइड डिस्ट्यूट 1 (एसओडी) का टर्मिनल टुकड़ा। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए टीडीपी25 के समुच्चय का एक हिस्सा थोड़ा मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा न्यूरो2ए सेल lysate के घुलनशील अंश में शामिल किया गया था। इसके अलावा, GFP टैग SOD1 ALS से जुड़े उत्परिवर्तन ले जाने के लाइव कोशिकाओं में एक धीमी प्रसार से पता चलता है । तदनुसार, हम यहां एफसीएस का उपयोग करके अपने प्रसार संपत्ति के माध्यम से प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने की प्रक्रिया शुरू करते हैं।

Introduction

एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से जुड़े प्रोटीन एकत्रीकरण, और इतने पर 1 विषाक्त होने के लिए जाना^जाता है और कोशिकाओं और अंगों में प्रोटीन होमोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) को परेशान करेगा, जो तब उम्र बढ़ने का कारण^बनसकता है। प्रोटीन एकत्रीकरण की मंजूरी एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में अपेक्षित है; हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण गठन को रोकने और प्रोटीन समुच्चय (जैसे, छोटे अणुओं या दवाओं) को नीचा दिखाने वाले रसायन अभी तक स्थापित नहीं किए गए हैं। इसके अलावा, प्रोटीन एकत्रीकरण विषाक्तता को कैसे लागू करता है, मायावी रहता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण से संबं....

Protocol

1. सामग्री और अभिकर् ता

1. सेल कल्चर(टेबल 1)के लिए पायरोजेनिक फ्री सॉल्यूशंस और मीडियम का इस्तेमाल करें।
2. अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके जैव रासायनिक प्रयोग के लिए समाधान तैयार करें और DNase/RNase मु.......

Discussion

माप से पहले सिस्टम अंशांकन के बारे में, नमूना मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान कांच के सामान का उपयोग किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 8-कुएं सेल लिस्लेट के लिए ग्लास चैंबर और जीवित कोशिकाओं के लिए 35-मि?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304