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Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.
L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.
Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington ecosì via sono note per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento2. La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltr....
1. Materiali e reagenti
Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata6. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizz.......
Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di co.......
A.K. è stato sostenuto da una sovvenzione della Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), da una sovvenzione della Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, da una sovvenzione dell'Ufficio universitario di Hokkaido per lo sviluppo dei futuri leader della ricerca (L-Station) e da una sovvenzione della Hoansha Foundation. M. K. è stato parzialmente supportato da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Chimica per biosistemi multimolecolari di affollamento" (#20H04686) e da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Fisica del....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
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