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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Abstract

L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.

Introduction

Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington ecosì via sono note per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento2. La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltr....

Protocol

1. Materiali e reagenti

  1. Utilizzare soluzioni e mezzi pirogenici liberi per la coltura cellulare(tabella 1).
  2. Preparare soluzioni per l'esperimento biochimico utilizzando acqua ultrapura e utilizzare come privo di DNasi/RNasi.
  3. Selezionare un FBS appropriato per le impostazioni cultura delle celle con un processo di controllo del lotto. Poiché il lotto FBS selezionato cambia regolarmente, il catalogo e il numero di lotto per FBS non possono essere rappresentati qui.
  4. .......

Representative Results

Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata6. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizz.......

Discussion

Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di co.......

Acknowledgements

A.K. è stato sostenuto da una sovvenzione della Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), da una sovvenzione della Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, da una sovvenzione dell'Ufficio universitario di Hokkaido per lo sviluppo dei futuri leader della ricerca (L-Station) e da una sovvenzione della Hoansha Foundation. M. K. è stato parzialmente supportato da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Chimica per biosistemi multimolecolari di affollamento" (#20H04686) e da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Fisica del....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
100-mm plastic dishesCORNING430167
35-mm glass base dishIWAKI3910-035For live cell measurement
35-mm plastic dishesThermo Fisher Scientific150460
Aluminum plateBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl ZeissObjective
Cell scraperSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Cover glass chamber 8-wellsIWAKI5232-008For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796basal medium
Fetal bovine serum (FBS)bioseraLot check required
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cellsATCCCCL-131Cell line
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8304

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Revie....

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