Påvisning av proteinaggregering ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi

Summary

Vi introduserer her en prosedyre for å måle protein oligomerer og aggregering i cellelyse og levende celler ved hjelp av fluorescens korrelasjonsspektroskopi.

Abstract

Proteinaggregering er et kjennetegn på nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS) og så videre. For å oppdage og analysere løselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater, har fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som kan oppdage diffusjonshastigheten og lysstyrken til en enkelt partikkel med en enkelt molekylfølsomhet, blitt brukt. Imidlertid har riktig prosedyre og kunnskap for proteinaggregeringsdeteksjon ikke blitt mye delt. Her viser vi en standardprosedyre for FCS-måling for diffusjonsegenskaper av aggregasjonsutsatte proteiner i cellelyse og levende celler: ALS-assosiert 25 kDa karboksylterminalfragment av TAR DNA / RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoksiddismutase 1 (SOD1). De representative resultatene viser at en del av aggregater av grønt fluorescerende protein (GFP)-merket TDP25 var litt inkludert i den oppløselige brøkdelen av murin neuroblastom Neuro2a celle lysat. Videre viser GFP-merket SOD1 med ALS-assosiert mutasjon en langsommere diffusjon i levende celler. Følgelig introduserer vi her prosedyren for å oppdage proteinaggregering via diffusjonsegenskapen ved hjelp av FCS.

Introduction

Proteinaggregasjoner som involverer nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntington sykdom og så videre¹ er kjent for å være giftige og vil forstyrre protein homeostase (proteostase) i celler og organer, som deretter kan føre til^{aldring 2}. Clearance av proteinaggregering forventes som en terapeutisk strategi; Imidlertid er kjemikalier som forhindrer proteinaggregasjonsdannelse og nedbrytningsproteinaggregater (f.eks. små molekyler eller legemidler) ikke fastslått ennå. Videre, hvordan proteinaggregasjon utøver toksisitet forblir unnvikende. Derfor, for å....

Protocol

1. Materialer og reagenser

1. Bruk pyrogene frie løsninger og medium for cellekultur (Tabell 1).
2. Forbered løsninger for det biokjemiske eksperimentet ved hjelp av ultrarent vann og bruk som DNase / RNase gratis.
3. Velg en passende FBS for cellekulturen med mye kontrollprosess. Siden det valgte FBS-partiet endres regelmessig, kan ikke katalogen og partinummeret for FBS representeres her.
4. Plasmid DNA
   1. Forbered pmeGFP-N1⁵ for eGFP monomerut.......

Discussion

Når det gjelder systemkalibrering før målinger, bør de samme glassene som den som ble brukt til å måle prøven brukes (f.eks. 8-brønners dekselglasskammeret for cellelys og 35 mm glassbasefat for levende celler). På grunn av adsorpsjonen av Rh6G på glasset, kan den effektive konsentrasjonen noen ganger reduseres. I så fall bør en svært konsentrert Rh6G-løsning som 1 μM brukes bare til pinhole-justeringen. Ekstremt høye fotontellingshastigheter må unngås for å beskytte detektoren (f.eks. mer enn 1000 kHz.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304