Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Resumo

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Resumo

A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.

Introdução

Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim por^{diante 1} são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento². Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agreg....

Protocolo

1. Materiais e reagentes

1. Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).
2. Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.
3. Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.
4. DNA plasmídeo
   1. Prepare pmeGFP-N1⁵ para expressão monômero eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ para expressão GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R^7<....

Resultados

Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada⁶. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Fig.......

Discussão

Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para p.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304