Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Summary

Aquí introducimos un procedimiento para medir oligomeros proteicos y agregación en lysato celular y células vivas utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Abstract

La agregación de proteínas es un sello distintivo de los trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer (AD), la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Huntington (EH), etc. Para detectar y analizar oligomeros o agregados de proteínas solubles o difusas, se ha utilizado espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), que puede detectar la velocidad de difusión y el brillo de una sola partícula con una sola sensibilidad a moléculas. Sin embargo, el procedimiento adecuado y el know-how para la detección de agregación de proteínas no han sido ampliamente compartidos. Aquí, mostramos un procedimiento estándar de medición del FCS para las propiedades de difusión de proteínas propensas a la agregación en lysato celular y células vivas: fragmento carboxil-terminal de 25 kDa asociado al ELA de ADN TAR/proteína de unión al ARN 43 kDa (TDP25) y desmutasa de superóxido 1 (SOD1). Los resultados representativos muestran que una parte de los agregados de proteína fluorescente verde (GFP) etiquetados TDP25 se incluyó ligeramente en la fracción soluble de neuroblastoma murino Neuro2a lisato celular. Además, el SOD1 etiquetado con GFP que lleva mutación asociada a la ELA muestra una difusión más lenta en las células vivas. En consecuencia, aquí introducimos el procedimiento para detectar la agregación de proteínas a través de su propiedad de difusión utilizando FCS.

Introduction

Se sabe que las agregaciones proteicas que involucran trastornos neurodegenerativos como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, etc.^{en 1,} son tóxicas y perturbarían la homeostasis proteica (proteostasis) en las células y órganos, que luego podrían conducir al envejecimiento^2. Se espera que el aclaramiento de la agregación de proteínas sea una estrategia terapéutica; sin embargo, todavía no se han establecido productos químicos que prevengan la formación de agregación de proteínas y degraden los agregados proteicos (por ejemplo, molécul....

Protocol

1. Materiales y reactivos

1. Utilice soluciones libres de pirogénicos y medios para el cultivo celular (Tabla 1).
2. Preparar soluciones para el experimento bioquímico utilizando agua ultrapura y utilizar como DNase / RNase libre.
3. Seleccione un FBS adecuado para la referencia cultural de celda con un proceso de comprobación de lote. Puesto que el lote FBS seleccionado cambia regularmente, el catálogo y el número de lote para FBS no se pueden representar aquí.
4. ADN p.......

Discussion

En cuanto a la calibración del sistema antes de las mediciones, se deben utilizar los mismos cristalerías que la utilizada para medir la muestra (por ejemplo, la cámara de vidrio de cubierta de 8 pozos para el lisato celular y la placa base de vidrio de 35 mm para células vivas). Debido a la adsorción de Rh6G en el vidrio, su concentración efectiva a veces puede disminuir. Si es así, se debe utilizar una solución Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, solo para el ajuste del agujero. Se deben evitar tasas de rec.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100-mm plastic dishes	CORNING	430167
35-mm glass base dish	IWAKI	3910-035	For live cell measurement
35-mm plastic dishes	Thermo Fisher Scientific	150460
Aluminum plate	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Objective
Cell scraper	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Cover glass chamber 8-wells	IWAKI	5232-008	For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	basal medium
Fetal bovine serum (FBS)	biosera		Lot check required
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cells	ATCC	CCL-131	Cell line
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1			Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8304