A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.
Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och så vidare. För att upptäcka och analysera lösliga eller diffusa proteinoligomer eller aggregat har fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektera diffusionshastigheten och ljusstyrkan hos en enda partikel med en enda molekylkänslighet, använts. Det korrekta förfarandet och know-how för proteinaggregeringsdetektering har dock inte delats i stor utsträckning. Här visar vi ett standardförfarande för FCS-mätning för diffusionsegenskaper hos aggregeringsbenägna proteiner i celllyat och levande celler: ALS-associerade 25 kDa karboxylterminalfragment av TAR DNA/ RNA-bindande protein 43 kDa (TDP25) och superoxiddemutas 1 (SOD1). De representativa resultaten visar att en del av aggregat av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt TDP25 var något ingår i den lösliga fraktionen av murin neuroblastom Neuro2a cell lysat. Dessutom visar GFP-märkta SOD1 bär ALS-associerade mutation en långsammare diffusion i levande celler. Följaktligen introducerar vi här proceduren för att upptäcka proteinaggregeringen via dess diffusionsegenskap med FCS.
Proteinaggregeringar som involverar neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och såvidare 1 är kända för att vara giftiga och skulle störa proteinhomeostas (proteostas) i cellerna och organen, som sedan kan leda till åldrande2. Clearance av proteinaggregering förväntas som en terapeutisk strategi; Kemikalier som förhindrar proteinaggregeringsbildning och bryter ned proteinaggregat (t.ex. små molekyler eller läkemedel) har dock ännu inte fastställts. Dessutom är hur proteinaggregering utövar toxicitet fortfarande svårfångad. För att främ....
1. Material och reagenser
Vi utförde FCS mätning av GFP-TDP25 i cell lysat och SOD1-G85R-GFP i levande celler. I båda fallen kunde en positiv amplitud och smidiga ACFs förvärvas. Vi har visat att en del av GFP-TDP25 uttryckt i Neuro2a celler återfanns i lösliga fraktion under det angivnavillkoret 6. I den lösliga fraktionen av celllysatet upptäcktes extremt ljusa fluorescensmolekyler i fotonräkningshastigheten med FCS (Figur 2A, topp, pil). Sådana "spikar (även kallade burst)" obse.......
När det gäller systemkalibrering före mätningar bör samma glas som det som används för att mäta provet användas (t.ex. täcker 8-brunnarna glaskammaren för celllyat och 35 mm glasbasform för levande celler). På grund av adsorptionen av Rh6G på glaset kan dess effektiva koncentration ibland minska. I så fall bör en högkoncentrerad Rh6G-lösning som 1 μM användas endast för pinhole-justeringen. Extremt höga fotonantal måste undvikas för att skydda detektorn (t.ex. mer än 1000 kHz). Dessutom är den k.......
A.K. stöddes av ett bidrag från Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av ett stöd från Nakatani Foundation for Countermeasures mot nya coronavirusinfektioner, genom ett bidrag från Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) och ett bidrag i bistånd från Hoansha Foundation. M. K. stöddes delvis av ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Kemi för multimolekylära crowdingbiosystem" (#20H04686) och ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Informationsfysik i levande frågor" (#20H05522).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.