Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.

Abstract

Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och så vidare. För att upptäcka och analysera lösliga eller diffusa proteinoligomer eller aggregat har fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektera diffusionshastigheten och ljusstyrkan hos en enda partikel med en enda molekylkänslighet, använts. Det korrekta förfarandet och know-how för proteinaggregeringsdetektering har dock inte delats i stor utsträckning. Här visar vi ett standardförfarande för FCS-mätning för diffusionsegenskaper hos aggregeringsbenägna proteiner i celllyat och levande celler: ALS-associerade 25 kDa karboxylterminalfragment av TAR DNA/ RNA-bindande protein 43 kDa (TDP25) och superoxiddemutas 1 (SOD1). De representativa resultaten visar att en del av aggregat av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt TDP25 var något ingår i den lösliga fraktionen av murin neuroblastom Neuro2a cell lysat. Dessutom visar GFP-märkta SOD1 bär ALS-associerade mutation en långsammare diffusion i levande celler. Följaktligen introducerar vi här proceduren för att upptäcka proteinaggregeringen via dess diffusionsegenskap med FCS.

Introduction

Proteinaggregeringar som involverar neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och såvidare 1 är kända för att vara giftiga och skulle störa proteinhomeostas (proteostas) i cellerna och organen, som sedan kan leda till åldrande2. Clearance av proteinaggregering förväntas som en terapeutisk strategi; Kemikalier som förhindrar proteinaggregeringsbildning och bryter ned proteinaggregat (t.ex. små molekyler eller läkemedel) har dock ännu inte fastställts. Dessutom är hur proteinaggregering utövar toxicitet fortfarande svårfångad. För att främ....

Protocol

1. Material och reagenser

  1. Använd pyrogena fria lösningar och medium för cellkultur (tabell 1).
  2. Förbered lösningar för det biokemiska experimentet med ultrapurevatten och använd som DNase / RNase gratis.
  3. Välj en lämplig FBS för cellkulturen med mycket kontrollprocess. Eftersom det valda FBS-partiet ändras regelbundet kan katalogen och partinumret för FBS inte representeras här.
  4. Plasmid DNA
    1. Förbered pmeGFP-N15 för eGFP m.......

Representative Results

Vi utförde FCS mätning av GFP-TDP25 i cell lysat och SOD1-G85R-GFP i levande celler. I båda fallen kunde en positiv amplitud och smidiga ACFs förvärvas. Vi har visat att en del av GFP-TDP25 uttryckt i Neuro2a celler återfanns i lösliga fraktion under det angivnavillkoret 6. I den lösliga fraktionen av celllysatet upptäcktes extremt ljusa fluorescensmolekyler i fotonräkningshastigheten med FCS (Figur 2A, topp, pil). Sådana "spikar (även kallade burst)" obse.......

Discussion

När det gäller systemkalibrering före mätningar bör samma glas som det som används för att mäta provet användas (t.ex. täcker 8-brunnarna glaskammaren för celllyat och 35 mm glasbasform för levande celler). På grund av adsorptionen av Rh6G på glaset kan dess effektiva koncentration ibland minska. I så fall bör en högkoncentrerad Rh6G-lösning som 1 μM användas endast för pinhole-justeringen. Extremt höga fotonantal måste undvikas för att skydda detektorn (t.ex. mer än 1000 kHz). Dessutom är den k.......

Acknowledgements

A.K. stöddes av ett bidrag från Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av ett stöd från Nakatani Foundation for Countermeasures mot nya coronavirusinfektioner, genom ett bidrag från Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) och ett bidrag i bistånd från Hoansha Foundation. M. K. stöddes delvis av ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Kemi för multimolekylära crowdingbiosystem" (#20H04686) och ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Informationsfysik i levande frågor" (#20H05522).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
100-mm plastic dishesCORNING430167
35-mm glass base dishIWAKI3910-035For live cell measurement
35-mm plastic dishesThermo Fisher Scientific150460
Aluminum plateBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl ZeissObjective
Cell scraperSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Cover glass chamber 8-wellsIWAKI5232-008For solution measurement
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796basal medium
Fetal bovine serum (FBS)bioseraLot check required
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS system
Murine neuroblastoma Neuro2a cellsATCCCCL-131Cell line
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plasmid DNA for the transfection carrier
Penicillin-Streptomycin Solution (×100 )Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP
pmeGFP-N1Plasmid DNA for eGFP monomer expression
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8304

References

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Revie....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More