Protein Biomarker Seeker software is vrij beschikbaar (gratis) door contact op te nemen met Clifton K. Fagerquist op clifton.fagerquist@usda.gov. We willen de steun van dit onderzoek erkennen door ARS, USDA, CRIS-subsidie: 2030-42000-051-00-D.

1. Microbiologische monstervoorbereiding
<ol><li>Ent 25 ml Luria-bouillon (LB) in een conische buis van 50 ml met E. coli O113:H21 stam RM7788 (of een andere bacteriestam) uit een glycerolvoorraad met behulp van een steriele lus van 1 μL. Beding de buis en de voorkweek op 37 °C met schudden (200 rpm) gedurende 4 uur.</li>
	<li>Aliquot 100 μL voorgekweekte bouillon en verspreid op een LB agarplaat aangevuld met 400 of 800 ng / ml mitomycine-C. Kweek agar platen statisch 's nachts in een incubator bij 37 °C....

Overwegingen bij het protocol De belangrijkste sterke punten van het huidige protocol zijn de snelheid, eenvoud van monstervoorbereiding en het gebruik van een instrument dat relatief eenvoudig te bedienen, te trainen en te onderhouden is. Hoewel bottom-up en top-down proteomische analyse door vloeistofchromatografie-ESI-HR-MS alomtegenwoordig zijn en in veel opzichten veel beter dan top-down door MALDI-TOF-TOF, vereisen ze meer tijd, arbeid en expertise. De complexiteit van instrumenten kan vaak van ...

Analyse en identificatie van onverteerde eiwitten door massaspectrometrie wordt de top-down proteomische analyse1,2,3, 4genoemd. Het is nu een gevestigde techniek die gebruik maakt van elektrospray ionisatie (ESI)5 en hoge resolutie massaanalysatoren6, en geavanceerde dissociatie technieken, bijvoorbeeld elektron overdracht dissociatie (ETD), elektronenvangst dissociatie (ECD)7, ultraviolette foto-dissociatie (UV-PD)8, enz.
De andere zachte ionisatietechniek is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI)9,10,11 die minder uitgebreid is gebruikt voor de top-down analyse, deels omdat het voornamelijk is gekoppeld aan time-of-flight (TOF) massaanalysatoren, die een beperkte resolutie hebben in vergelijking met andere massaanalysatoren. Ondanks deze beperkingen zijn MALDI-TOF- en MALDI-TOF-TOF-instrumenten gebruikt voor de snelle top-down analyse van zuivere eiwitten en gefractioneerde en ongefractioneerde mengsels van eiwitten. Voor de identificatie van zuivere eiwitten is in-source decay (ISD) een bijzonder nuttige techniek omdat het massaspectrometrie (MS) analyse van ISD-fragmentionen mogelijk maakt, evenals tandem massaspectrometrie (MS / MS) van eiwitionfragmenten die sequentiespecifiek fragment leveren, vaak van de N- en C-termini van het doeleiwit, analoog aan Edman-sequencing12,13 . Een nadeel van de ISD-benadering is dat, net als bij Edman-sequencing, het monster slechts één eiwit mag bevatten. De enige eiwitbehoefte is te wijten aan de behoefte aan eenduidige toeschrijving van fragmentionen aan een voorloperion. Als er twee of meer eiwitten in een monster aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om toe te wijzen welke fragmentionen tot welke voorloperionen behoren.
Fragment ion/precursor ion attributie kan worden aangepakt met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Zoals bij elk klassiek MS/MS-experiment worden precursorionen massaal geselecteerd/geïsoleerd voorafgaand aan fragmentatie, en de gedetecteerde fragmentionen kunnen worden toegeschreven aan een specifiek voorloperion. De voor deze benadering beschikbare dissociatietechnieken zijn echter beperkt tot voornamelijk hoge-energie botsing-geïnduceerde dissociatie (HE-CID)14 of post-source decay (PSD)15,16. HE-CID en PSD zijn het meest effectief in het fragmenteren van peptiden en kleine eiwitten, en de sequentiedekking kan in sommige gevallen beperkt zijn. Bovendien resulteert PSD in polypeptide backbone cleavage (PBC) voornamelijk aan de C-terminale kant van asparagine- en glutaminezuurresiduen door een fenomeen dat het asparaginezuureffect wordt genoemd17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS heeft ook een nichetoepassing gevonden in de taxonomische identificatie van micro-organismen: bacteriën21,schimmels22en virussen23. MS-spectra worden bijvoorbeeld gebruikt om onbekende bacteriën te identificeren in vergelijking met een referentiebibliotheek van MS-spectra van bekende bacteriën met behulp van patroonherkenningsalgoritmen voor vergelijking. Deze aanpak is zeer succesvol gebleken vanwege de snelheid en eenvoud, hoewel het een nachtelijke kweek van het isolaat vereist. De eiwitionen die door deze benadering worden gedetecteerd (meestal minder dan 20 kDa) bestaan uit een MS-vingerafdruk die taxonomische resolutie mogelijk maakt op geslachts- en soortniveau en in sommige gevallen op de ondersoort24 en stamniveau25,26. Er blijft echter een noodzaak om niet alleen taxonomisch potentieel pathogene micro-organismen te classificeren, maar ook specifieke virulentiefactoren, toxines en antimicrobiële resistentie (AMR) factoren te identificeren. Om dit te bereiken, wordt de massa van peptiden, eiwitten of kleine moleculen gemeten door MS en vervolgens geïsoleerd en gefragmenteerd door MS / MS.
Pathogene bacteriën dragen vaak cirkelvormige stukjes DNA die plasmiden worden genoemd. Plasmiden, samen met profagen, zijn een belangrijke vector van horizontale genoverdracht tussen bacteriën en zijn verantwoordelijk voor de snelle verspreiding van antimicrobiële resistentie en andere virulentiefactoren over bacteriën. Plasmiden kunnen ook antibacteriële (AB) genen dragen, bijvoorbeeld colicine en bacteriocine. Wanneer deze genen tot expressie worden gebracht en de eiwitten worden uitgescheiden, werken ze om de eiwitvertalingsmachinerie van naburige bacteriën die dezelfde milieuniche bezetten uit te schakelen27. Deze bacteriedodende enzymen kunnen echter ook een risico vormen voor de gastheer die ze heeft geproduceerd. Als gevolg hiervan wordt een gen mede tot expressie gebracht door de gastheer dat specifiek de functie van een AB-enzym remt en wordt aangeduid als het immuniteitseiwit (Im).
DNA-beschadigende antibiotica zoals mitomycine-C en ciprofloxacine worden vaak gebruikt om de SOS-respons te induceren in Shiga-toxineproducerende E. coli (STEC) waarvan het Shiga-toxinegen(stx) wordt aangetroffen in een profaaggenoom dat aanwezig is in het bacteriële genoom28. We hebben eerder antibiotica-inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS en top-down proteomische analyse gebruikt om Stx-typen en subtypen geproduceerd door STEC-stammen29,30,31, 32te detecteren enteidentificeren. In het vorige werk werd STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op agarmedia aangevuld met mitomycine-C. In plaats van de verwachte B-subeenheid van Stx2a bij m/z ~7816 te detecteren, werd echter een ander eiwition gedetecteerd bij m/z ~7839 en geïdentificeerd als een plasmide-gecodeerd hypothetisch eiwit met onbekende functie33. In het huidige werk identificeerden we twee plasmide-gecodeerde AB-Im-eiwitten geproduceerd door deze stam met behulp van antibiotische inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, en top-down proteomische analyse met behulp van stand-alone software die is ontwikkeld om silico-eiwitsequenties afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) te verwerken en te scannen. Daarnaast werd de mogelijkheid van post-translation modifications (PTM) met sequentie-afkapping in de software opgenomen. De immuniteitseiwitten werden met behulp van deze software geïdentificeerd uit de gemeten massa van het volwassen eiwition en sequentiespecifieke fragmentionen van PBC veroorzaakt door het asparaginezuureffect en gedetecteerd door MS / MS-PSD. Ten slotte werd een promotor geïdentificeerd stroomopwaarts van de AB / Im-genen in een plasmide-genoom dat de expressie van deze genen kan verklaren wanneer deze stam wordt blootgesteld aan een DNA-beschadigend antibioticum. Delen van dit werk werden gepresenteerd op de National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 augustus 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Dit protocol identificeert de immuniteitseiwitten van de bacteriedodende enzymen: colicine E3 en bacteriocine, geproduceerd door een pathogene Escherichia coli-stam met behulp van antibiotica-inductie, en geïdentificeerd door MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met software die intern is ontwikkeld. Het immuniteitseiwit colicine E3 (Im3) en het immuniteitseiwit van bacteriocine (Im-Bac) werden geïdentificeerd uit prominente b- en/of y-type fragmentionen gegenereerd door de polypeptide backbone cleavage (PBC) aan de C-terminale kant van asparaginezuur, glutaminezuur en asparagineresiduen door het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect. De software scant snel in silico-eiwitsequenties die zijn afgeleid van de hele genoomsequencing van de bacteriestam. De software verwijdert ook iteratief aminozuurresiduen van een eiwitsequentie in het geval dat de volwassen eiwitsequentie wordt afgekapt. Een enkele eiwitsequentie bezat massa- en fragmentionen die consistent waren met die gedetecteerd voor elk immuniteitseiwit. De kandidaatsequentie werd vervolgens handmatig geïnspecteerd om te bevestigen dat alle gedetecteerde fragmentionen konden worden toegewezen. De N-terminale methionine van Im3 werd post-translationeel verwijderd, terwijl Im-Bac de volledige sequentie had. Bovendien ontdekten we dat slechts twee of drie niet-complementaire fragmentionen gevormd door PBC nodig zijn om de juiste eiwitsequentie te identificeren. Ten slotte werd een promotor (SOS-box) geïdentificeerd vóór de antibacteriële en immuniteitsgenen in een plasmidegenoom van de bacteriestam.

Figuur 3 (bovenpaneel) toont de MS van STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op LBA aangevuld met 400 ng/ml mitomycine-C. Pieken bij m/z 7276, 7337 en 7841 waren eerder geïdentificeerd als cold-shock protein C (CspC), cold-shock protein E (CspE) en een plasmide-borne protein met onbekende functie, respectievelijk33. Het eiwition bij m/z 9780 [M+H]+ werd geanalyseerd door MS/MS-PSD zoals weergegeven in figuur 3 (onderste...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Het protocol demonstreert een snelle methode voor de identificatie van bacteriële eiwitten met behulp van antibiotica-inductie en massaspectrometrie. Het grote voordeel van de techniek is de snelheid en eenvoud. Monstervoorbereiding is ongecompliceerd.De techniek kan worden uitgebreid tot de karakterisering van pathogene bacteriën, zoals virulentiefactoren of antibioticaresistentie om een geschikte behandeling voor een bacteriële infectie beter te informeren. Gebruik om te beginnen een steriele lus van één microliter om bacteriën te oogsten uit enkele kolonies die op LB-agarplaat worden gekweekt. En breng over op een twee milliliter O-ring ring lijn schroefdop microcentrifuge buis met 300 microliter HPLC-kwaliteit water.Draai vervolgens kort de buis en pellet de cellen door centrifugering, in een relikwiewater van 0,75 microliter van het monstersupernatant op het roestvrijstalen MALDI-doelwit, en laat het drogen. Overlay de gedroogde monstervlek met 0,75 microliter van een verzadigde oplossing van sinapinic acid bereid in 33% acetonitril, 67% water en 0,2% trifluoro-azijnzuur, en laat de vlek drogen. Zodra de vlek is gedroogd, laadt u het doelwit in de massaspectrometer.Open de acquisitiesoftware en klik op MS Linear Mode Acquisition Of mass-to-charge range en mass-to-charge van de onder- en bovengrenzen in hun respectievelijke velden. Klik op de monsterspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor een laserablatie of ionisatie.Laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 1000 laserschoten voor elke monsterplek. Als er geen ionen worden gedetecteerd, verhoogt u de laserintensiteit door de glijdende schaalbalk onder laserintensiteit aan te passen totdat het eiwitionensignaal wordt gedetecteerd. Nadat u de MS Linear Mode Acquisition hebt voltooid, klikt u op de MS/MS Reflectron Mode Acquisition.Voer de te analyseren voorlopermassa in het veld Precursor Mass in. Voer vervolgens een isolatiebreedte in daltonen in het venster Precursor Mass in voor de lage en hoge massazijde van de voorlopermassa. Klik op de knop CID Uit.Klik vervolgens op de knop Metastable Suppressor On. Pas de laserintensiteit aan tot ten minste 90% van de maximale waarde door de glijdende schaalbalk aan te passen zoals gedemonstreerd. Klik op de monsterplek die moet worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon, druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de cursor over de monstervlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie of ionisatie, laat de muisknop los om de acquisitie te starten en verzamel 10.000 laserfoto's voor elke monsterplek zoals gedemonstreerd.Dubbelklik op het uitvoerbare bestand Protein Biomarker Seeker en het venster van de grafische gebruikersinterface verschijnt. Voer de massa van de eiwitbiomarker in het veld Mature Protein Mass in en de massameetfout in het veld Mass Tolerance in. Klik optioneel op de knop Complimentary b/y ion Protein Mass Calculator om de eiwitmassa te berekenen uit een vermeende complementaire fragmentionenpaar en het pop-upvenster van de Protein Mass Calculator Tool verschijnt.Voer de verhouding tussen massa en lading van het vermeende complementaire fragmentionenpaar in, klik op de knop Paar toevoegen en de Calculator Protein Mass verschijnt. Kopieer deze waarde in het veld Mature Protein Mass en sluit het gereedschapsvenster Protein Mass Calculator. Klik op het vak Residubeperking instellen.Selecteer de peptidelengte van het eindterminaalsignaal en de pop-up met een glijdende schaal en cursor verschijnt en verplaatst de cursor naar de gewenste signaalpeptidelengte. Als de signaalpeptidelengte niet is geselecteerd, wordt een onbeperkte sequentie-afkapping uitgevoerd door de software. Selecteer onder de Fragment Ion Condition de Residues For Polypeptide Backbone Cleavage door op de vakjes van een of meer residuen, D-E-N en/of P. te klikken En klik vervolgens op de Enter Fragment Ions Plus One to be search knop, en de pop-up fragment pagina zal verschijnen.Klik vervolgens op de knop Fragmention toevoegen en er verschijnt een vervolgkeuzeveld voor elk fragmention dat moet worden ingevoerd. Voer de massa in op ladingsverhoudingen van de fragmentionen en de bijbehorende massa door ladingstolerantie. Klik vervolgens op de knop Opslaan en sluiten.Blader in het rechtervak van Hoeveel fragmentionen moeten worden gematcht om het minimumaantal fragmentionen te selecteren dat moet worden gematcht voor identificatie en selecteer de cysteïneresiduen in hun geoxideerde toestand. Als de eiwitten na de zoekopdracht niet worden geïdentificeerd, herhaalt u de zoekopdracht met cysteines in hun verminderde toestand. Klik onder Bestandsinstellingen op het pictogram FASTA-bestand selecteren om door het FASTA-bestand te bladeren en het TE SELECTEREN dat de in silico-eiwitsequenties van de eerder geconstrueerde bacteriestam bevat.Selecteer vervolgens een uitvoermap en maak een uitvoerbestandsnaam. Klik op het pictogram Zoekopdracht uitvoeren op bestandsvermeldingen. Er verschijnt een pop-upvenster met de titel Zoekparameters bevestigen waarin de zoekparameters worden weergegeven voordat de zoekopdracht wordt gestart.En als de zoekparameters correct zijn, klikt u op Zoekopdracht starten. Als de parameters onjuist zijn, klikt u op Annuleren en voert u de juiste parameters opnieuw in. Zodra de zoekopdracht is gestart, wordt het parametervenster gesloten en verschijnt er een nieuw pop-upvenster met een voortgangsbalk, met de voortgang van de zoekopdracht en een lopende telling van het aantal gevonden identificaties.Na voltooiing van de zoekopdracht wordt de voortgangsbalk automatisch gesloten en wordt een samenvatting van de zoekopdracht weergegeven in het logveld van de grafische gebruikersinterface, samen met een nieuw pop-upvenster met de gevonden eiwitidentificaties. In de huidige studie werden bacterieculturen gekweekt in LB met twee verschillende concentraties mytomycine-C. Het massaspectrum van bacteriekweek gekweekt met een mytomycine-C-concentratie.Cold shock protein C, cold shock protein E en een plasmide-borne protein met onbekende functie werden geïdentificeerd. Het onbekende eiwition op 9780 werd geanalyseerd door MS / MS, en het voorloperion werd geïsoleerd met een tijdionenselectievenster van ongeveer 100 dalton. Het fragmention bij massa om 9675,9 te laden is overloop van de dissociatie van het metastabieerbare eiwition bij 9655.De sequentie van het immuniteitseiwit voor colicine E3 bevat basisresidu mogelijke plaatsen van ionisatie. De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. De N-terminale methionine wordt verwijderd als een post-translatie modificatie.Toen de bacteriecultuur werd gekweekt met een hoge mytomycine-C-concentratie, werd het immuniteitseiwit van bacteriocine geïdentificeerd. De onbekende piek bij 9651 werd geanalyseerd door MS / MS en het voorloperion werd geïsoleerd met een smaller en asymmetrisch TIS-venster van minus 75 plus 60 dalton. De sequentie van het immuniteitseiwit van bacteriocine bevat basisresiduen mogelijke plaatsen van ionisatie.De fragmentionen gedetecteerd uit polypeptide backbone splitsing, wanneer de gereduceerde vorm van cysteïne werd gebruikt tijdens de zoektocht. met de verschillende concentraties antibiotica kan de relatieve eiwitrijkdom variëren. Deze werden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.Let bij het oogsten van bacteriële cellen op koloniemorfologie en bacteriegroei met betrekking tot antibiotica en concentratie. Een lus van één microliter cellen is nodig om eiwitten te detecteren.