Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

Ce protocole identifie les protéines immunitaires des enzymes bactéricides : la colicine E3 et la bactériocine, produites par une souche pathogène d’Escherichia coli à l’aide d’une induction antibiotique, et identifiées par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. La protéine d’immunité de la colicine E3 (Im3) et la protéine d’immunité de la bactériocine (Im-Bac) ont été identifiées à partir d’ions fragments proéminents de type b et/ou y générés par le clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) sur le côté C-terminal de l’acide aspartique, de l’acide glutamique et des résidus d’asparagine par le mécanisme de fragmentation de l’effet de l’acide aspartique. Le logiciel scanne rapidement les séquences protéiques in silico dérivées du séquençage du génome entier de la souche bactérienne. Le logiciel élimine également de manière itérative les résidus d’acides aminés d’une séquence protéique dans le cas où la séquence protéique mature est tronquée. Une seule séquence protéique possédait des ions de masse et de fragment cohérents avec ceux détectés pour chaque protéine d’immunité. La séquence candidate a ensuite été inspectée manuellement pour confirmer que tous les ions fragments détectés pouvaient être attribués. La méthionine N-terminale d’Im3 a été enlevée post-traductionnellement, tandis que Im-Bac avait la séquence complète. De plus, nous avons constaté que seulement deux ou trois ions fragments non complémentaires formés par la CBP sont nécessaires pour identifier la séquence protéique correcte. Enfin, un promoteur (SOS box) a été identifié en amont des gènes antibactériens et immunitaires dans un génome plasmidique de la souche bactérienne.