我们要感谢袁田博士（tian.yuan@ucl.ac.uk）能够回答有关ChAMP软件包的所有疑问。我们还感谢Guilherme Telles，Msc.从本文对技术和科学问题的贡献;他对表观遗传学和视频捕获和格式化技术（guilherme.telles@usp.br）进行了重要考虑。耗材资助：圣保罗研究基金会（FAPESP）（#2018/24069-3）和国家科学技术发展委员会（CNPq：#408292/2018-0）。个人资助：（FAPESP：#2014/16740-6）和高等教育人员发展协调学术卓越计划（CAPES：88882.180020/2018-01）。数据将不受限制地公开和免费提供。与NYN（电子邮件：nataliayumi@usp.br）或CBN（电子邮件：carla@fmrp.usp.br）的通信地址。

本文的作者没有利益冲突，也没有财务披露要声明。

DNA甲基化阵列是获取DNA甲基化最常用的方法，因为它们具有成本效益14。本研究描述了一种详细的方案，该方案使用市售的微阵列平台在巴西队列中进行的试点研究中评估DNA甲基化。从试点研究中获得的结果证实了该方案的有效性。 图3 显示了样品的可比性和完整的亚硫酸氢盐转化率32。
作为质量控制步骤，ChAMP算法建议在过滤过程中排除CpGs站点。排除探针的目的是改进数据分析并消除偏差。去除低质量的CpG（p值低于0.05）以消除数据集中的实验噪声。目标在密度图分析中保持通过状态。Zhou33 描述了在SNP附近过滤CpG的重要性，以避免不匹配，误解多态性胞嘧啶的甲基化，并导致I型探针设计的开关颜色34。此外，由于XY染色体受到印记的差异性影响，Heiss和Just35 强调了过滤这些探针的重要性，因为在女性中，杂交问题可能是混淆因素35。
DMAP的有效期、甲酰胺开放日期、无水乙醇的分析质量和总白细胞计数被认为是方案中的关键步骤。
此外，根据我们的观察，细胞类型估计对于进行生物信息学分析至关重要。豪斯曼方法执行细胞类型估计，如Tian的研究30中所述。该方法基于473个特定的CpG位点，可以预测最重要细胞类型的百分比，例如粒细胞，单核细胞，B细胞和T细胞36。我们使用了ChAMP软件包中推荐的函数“myRefbase”。估计后，ChAMP 算法会调整 beta 值，并从数据集中消除此偏差。这一步在专注于肥胖的研究中至关重要，因为由于其慢性炎症状态，这一人群在白细胞中具有相当大的差异。
我们仅更改了普通PCR密封的原始盖图，涉及方法修改和故障排除。每次离心过程后，密封件都更换为新的密封件。我们不能使用标准的热封，而是在板周围使用铝箔进行调整。
虽然商业检测被认为是表观遗传学研究的黄金标准，但该协议的一个局限性可能是来自独特品牌的试剂和设备的特异性37，38，39，40。另一个限制是缺乏能够识别实验正确进展的指标41。
本方案的标准化代表了表观遗传学研究的重要指南，减少了过程中的人为错误，并允许成功的数据分析和不同研究之间的可比性。
根据我们的结果，DNA甲基化实验适用于比较有和没有肥胖的个体的研究43。此外，拟议的生物信息学分析提供了高质量的数据，可以在大规模研究中加以考虑。
使用SVD分析，我们发现肥胖相关性状（BMI，WC和FM）影响了DNA甲基化数据的变异性。作为一项重要结果，细胞类型估计表明，肥胖女性的自然杀伤细胞（NK）和B细胞均高于非肥胖女性（图5）。这些细胞的较高计数可以通过这些个体的低度炎症状态来解释44。我们观察到，肥胖患者在与脂肪量相关的基因的启动子区域中具有低甲基化和高甲基化的CpG。大多数位点被低甲基化，这可能与这些个体中活性氧（ROS）水平的自然增加有关。这种氧化应激条件可能促进鸟嘌呤在二核苷酸位点的扰动，形成8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG），导致5mCp-8-OHdG二核苷酸位点，并引起TET酶募集。所有这些事件都可能通过不同的作用机制促进DNA低甲基化和高甲基化45。
此外，肥胖个体的脂肪发生率似乎增加，大约10%的新细胞为旧细胞46，47。表观遗传贡献强调致肥胖环境，可以改变细胞的增殖和分化速率，有利于脂肪团的发育48。表观遗传变化也会影响脂肪生成程序，促进或限制其发展。主要转录因子（PPARγ或C / EBPα）或多蛋白复合物的组装，位于下游启动子区域，通过包括或排除表观遗传修饰酶来操作，通过高甲基化或低甲基化调节基因表达45。PPARγ通路以前曾被描述为改变WNT通路，该通路在这项研究中富集了基因。虽然目前尚不清楚WNT信号传导在脂肪生成过程中是如何发生的，但最近的研究表明，它可能在脂肪细胞代谢中具有重要作用，特别是在致肥胖条件下49。

大规模组学技术越来越多地用于慢性病研究。这些方法的一个有趣的特点是向科学界提供大量生成的数据。因此，出现了标准化方案的需求，以便对研究进行技术比较。本研究建议使用试点研究作为应用示例，对获取和分析DNA甲基化数据的方案进行标准化。
负能量消耗在现代人类生活方式中占主导地位，导致脂肪组织过度积累，从而导致肥胖的发展¹。许多因素增加了肥胖率，例如久坐不动，高热量饮食和紧张的日常工作。世界卫生组织（WHO）估计，2016年有19亿成年人肥胖，这意味着超过20%的世界人口BMI2超过30公斤/平方米。2018 年的最新更新显示，美国（USA）的肥胖患病率高于 42%3。
表观遗传学是染色体区域的结构适应性，以记录，信号或延续改变的活性状态4。DNA甲基化是胞嘧啶-鸟苷二核苷酸位点（CpG位点）的可逆化学改变，形成5-甲基胞嘧啶-pG（5mCpG）。它可以通过调节转录机制对DNA的访问来调节基因表达5，6，7，8。在这种情况下，了解哪些CpG位点与肥胖相关特征相关是至关重要的9。许多因素可以支持或阻止位点特异性DNA甲基化。该过程所需的酶，如DNA甲基转移酶10 （DNTMs）和10-11转位（TETs），可以在环境暴露下促进DNA甲基化或去甲基化11。
考虑到过去几年对DNA甲基化研究的兴趣日益浓厚，选择最合适的分析策略来精确回答每个问题一直是研究人员的基本关注点12，13，14。450K DNA甲基化阵列是最受欢迎的方法，在360多篇出版物中使用14来确定DNA甲基化谱。它可以确定位于99%已知基因中的多达485，000个CpG的甲基化15。但是，该阵列已停产，取而代之的是 EPIC，覆盖 850，000 个 CpG 站点。目前的协议可以同时适用于450K和EPIC16，17，18。
该方案在 图1 中逐步呈现，包括以下步骤：群体选择，采样，实验制备，DNA甲基化管道和生物信息学分析。这里演示了在我们实验室进行的试点研究，以说明拟议方案的步骤。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig01.jpg"> 图 1：所介绍协议的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>B5924-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel</td>
			<td>Kasvi</td>
			<td>K9-9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric bioimpedance</td>
			<td>Quantum BIA 450 Q - RJL System</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation-Gold kit</td>
			<td>ZymoResearch, Irvine, CA, USA</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMS&#8212;Fragmentation solution</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11203428</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HumanMethylation450 BeadChip</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell Instrument</td>
			<td>Promega, Brazil</td>
			<td>AS4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA1&#8212;Multi-Sample Amplification 1 Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11202880</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201703982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSM&#8212;Multi-Sample Amplification Master Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11203410</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>F. MAIA</td>
			<td>114700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PB1&#8212;Reagent used to prepare BeadChips for hybridization</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11291245</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PB2&#8212;Humidifying buffer used during hybridization</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11191130</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Emsure</td>
			<td>10,96,34,01,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA1&#8212;Resuspension, hybridization, and wash solution</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11292441</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPM&#8212;Random Primer Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15010230</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STM&#8212;Superior Two-Color Master Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11288046</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM&#8212;Two-Color Extension Master Mix</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11208309</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>155576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td>ByoSystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC1&#8212;XStain BeadChip solution 1</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11208288</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC2&#8212;XStain BeadChip solution 2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11208296</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC3&#8212;XStain BeadChip solution 3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11208392</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC4&#8212;XStain BeadChip solution 4</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>11208430</td>
			<td>Supplied Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation to bioinformatics analysis of dna methylation: association strategy for obesity and related trait studies

肥胖与生活方式直接相关，并且与DNA甲基化变化有关，这些变化可能导致脂肪生成和脂质储存过程的改变，从而导致疾病的发展。我们展示了从选择到有或没有肥胖患者的表观遗传学数据分析的完整方案。该协议的所有步骤都在试点研究中进行了测试和验证。32名妇女参加了这项研究，其中15人根据体重指数（BMI）被归类为肥胖（45.1±5.4公斤/平方米）;根据BMI（22.6±1.8 kg / m2）对17个没有肥胖的个体进行分类。在肥胖组中，通过线性回归分析鉴定了564个与脂肪量相关的CpG位点。CpG站点位于发起方区域。差异分析发现，肥胖个体中有470个CpGs低甲基化位点和94个高甲基化位点。RUNX中最低甲基化的富集途径是 RUNX， WNT 信号传导和对缺氧的反应。高甲基化途径与胰岛素分泌、胰高血糖素信号传导和Ca2+有关。我们得出结论，该协议有效地鉴定了DNA甲基化模式和与性状相关的DNA甲基化。这些模式可能与基因表达的改变有关，影响脂肪生成和脂质储存。我们的研究结果证实，致肥胖的生活方式可以促进人类DNA的表观遗传变化。

使用ChAMP管道后，在所有过滤器（不合格的CpG，非CG探针，SNP附近的CpG，多命中位点以及与XY相关的CpG）之后，分析中考虑了409，887个探针; 图 2 中显示了一个方案。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig02.jpg"> 图 2：生物信息学分析的管道。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
此外，密度图显示，所有样品的β分布密度与质量控制步骤相似。此分析评估 beta 值的分布，并指出是否有任何样本需要排除。在这一批中，没有根据该分析排除任何样品。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig03.jpg"> 图 3：使用 ChAMP 软件包获得的 Beta 值密度图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
采用奇异值分解（SVD）分析验证了显著影响DNA甲基化数据变异性的主成分。数据显示，BMI、WC（p <1e10-5）和FM（p <0.05）对数据变异性有显著影响（图4）。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig04.jpg"> 图 4：奇异值分解分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大图。</a>
细胞类型估计显示，肥胖女性的自然杀伤细胞（NK）和B细胞都较高（图5）。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig05.jpg"> 图5：通过豪斯曼方法估计的细胞分数。颗粒：粒细胞。 CD4T：辅助性T细胞，淋巴细胞。CD8T：细胞毒性T细胞，淋巴细胞。单核细胞：单核细胞。B细胞：B淋巴细胞。NK：自然杀伤细胞，淋巴细胞。*p < 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
肥胖和非肥胖女性之间的DNA甲基化水平在细胞类型校正之前和之后都存在差异。在对细胞类型进行DNA甲基化数据校正之前，观察到43，463个差异甲基化位置（DMP），之后观察到3，329个CpG仍然显着。445个CpG位点位于基因间区域（IGR），2，884个位于基因区域，大多数位于启动子区域（n = 1，438）。沿所有区域的分布分别为TSS1500（n = 612），TSS200（n = 826），5'UTR（n = 390），第一个外显子（n = 273），主体（n = 724）和3'UTR（n = 59）。考虑到Δβ值<-0.05和>0.05，与非肥胖个体相比，肥胖者中有162个CpG被低甲基化，576个CpG被高甲基化（图6）。这些数据可在GEO数据库中获得，注册代码为GSE166611。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig06.jpg"> 图 6：差异甲基化位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig06large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
可以评估组间不同的甲基化，并在甲基化研究中发现与特定性状相关的CpG位点。对于脂肪量研究，发现了13，222个CpG位点。启动子区域的6，159个CpG与脂肪量有关，其中470个高甲基化和94个低甲基化（图7），并且各自的基因富集（表2）。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62598/62598fig07.jpg"> 图 7：低甲基化和高甲基化基因的启动子区域，与脂肪量独立相关。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/62598fig07large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
表2：来自差异甲基化CpG位点的基因的功能富集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
补充材料1：<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62598/Supplementary%20Material_1.docx" target="_blank">请点击此处下载本文件。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies at JoVE.com

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

本研究描述了管理通过微阵列技术获得的DNA甲基化数据的工作流程。该协议演示了从样品制备到数据分析的步骤。详细描述了所有程序，视频显示了重要的步骤。

DNA甲基化生物信息学分析的样品制备：肥胖和相关性状研究的关联策略

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...

大规模组学技术越来越多地用于关注肥胖的研究。表观遗传学可能是暴露与健康结果之间的联系。这种类型的研究会产生大量的数据。鉴于此，重要的是要标准化协议，以使数据在技术上具有可比性。在这项研究中，我们将提出一个管道，以获得和分析DNA甲基化数据。相同的协议可以应用于400K和史诗版本。第一天：亚硫酸氢盐治疗。首先使基因组DNA变性，然后加入转化试剂。有必要遵循套件的建议。并用二磷酸盐处理变性DNA。然后将样品在热循环仪中孵育。使用洗涤缓冲液执行洗涤步骤。第二天：甲基化测定后扩增，手动方案。将杂交炉预热至37摄氏度，让温度平衡。将20微升MA1分散到板的孔中。将四微升的DNA转移到板上的相应孔中。将四微升氢氧化钠溶液分散到板孔中。用塑料密封密封板。涡旋板以将试剂与样品混合。在室温下孵育10分钟。将68微升RPM分散到每个孔中，然后分散75微升MSM而不除去先前的溶液。使用新的密封件覆盖板。涡旋板一分钟。在37摄氏度的杂交炉中孵育20至24小时。第三天：甲基化测定后的杂交，手动方案。通过将板插入37摄氏度来预热块。小心地从杂交炉中取出板。脉冲离心板。从板上取下密封件。向每个样品容器中加入50微升FMS。涡旋板一分钟。离心板需要。然后将密封板放在37摄氏度的加热块上一小时。向每个含有样品的孔中加入100微升PM1。再次密封板。涡旋板一分钟。在37摄氏度下孵育五分钟。然后在离心机中脉冲一分钟，然后用样品向每个孔中加入300微升100%2-丙醇。再次密封板。将所有内容物倒置至少10次。在4摄氏度下孵育30分钟，然后在4摄氏度下离心20分钟。从板上取下密封件。在适当的位置快速倒置板，丢弃上清液。用力敲击几次，直到您注意到所有孔都不含液体。在室温下，将盘子倒置并揭开一小时。干燥所有液体后，有必要在井的底部看到蓝色托盘。然后向每个孔中加入46微升RA1。将热封涂在板上。紧紧握住以均匀地进行密封。将盘子放入48摄氏度的杂交炉中一小时，然后涡旋一分钟。在离心机中脉冲，并将板在95摄氏度下加热一小时。一起准备BeadChip Hyb Chambers。在下一步中，将400微升PB2分散到Hyb室的储液器中。用PB2填充Hyb室储液器后，立即盖上盖子。小心地将每个样品从板中加载到微阵列的样品入口处。将含有微阵列的 Hyb 室插入物加载到 Hyb 室中。横向关闭 Hyb 室，以避免可能移动 Hyb 室。第四天：甲基化测定后染色，手动方案。夜间孵育后，从插入物中取出所有微阵列。并缓慢而轻柔地清洗微阵列，共10次，上下。将微阵列移动到第二个 PB1 容器，并上下重复 10 次。将流动室的框架放置在正确的位置，然后放置每个微阵列。在每个垫片的顶部使用透明垫片。对齐杆需要放置在对齐附件上。玻璃背板需要放在垫片的顶部。然后将金属夹具连接到流室。使用剪刀修剪流室垫片的末端。将带有微阵列的流动室放入腔室机架中。移液器150微升RA1。孵育30分钟，重复五次。移取450微升XC1，孵育10分钟。移取450微升XC2并孵育10分钟。移液器200微升TEM。孵育 15 分钟。移液器450微升95%甲酰胺。孵育一分钟，重复两次。孵育五分钟。移液器450微升XC3。孵育一分钟，然后重复。在此步骤中，将分配以下试剂，250微升STM，450微升XC3和250微升ATM。执行以下重复方案。在所有重复和孵育之后，将微阵列放在站立的架子上，然后将它们浸入洗涤容器中。缓慢而轻柔地移动，上下移动，10次。使用真空干燥器干燥微阵列50至55分钟。一旦微阵列干燥，继续用扫描对微阵列进行成像。在此图像中，我们可以看到使用的所有方案，从选择参与者到处理在甲基化实验的最后一天获得的IDAT文件。这些文件被传输到进行生物信息学分析的计算机。使用R Studio和生物导体ChAMP包处理分析。确保您的计算机上至少有八 GB 的 RAM。进行了其他生物信息学分析，例如基因富集，以更好地向读者呈现数据。在此表中，我们可以观察本研究中使用的两组，肥胖和非肥胖。变量，体重指数，腹围，千克脂肪量和脂肪量百分比的组间存在差异。观察此图中呈现的方案，我们能够理解拟议的协议对于我们的数据是足够的。在生物信息学分析之后，在进行过滤器后，总共出现了409，887个探针。密度图显示，所有样本的β分布密度相似。根据这些分析，没有排除任何样本。归一化数据的奇异值分解分析表明，BMI、双C和FM显著影响了DNA甲基化数据的变异性。细胞类型估计显示，自然杀伤细胞，NK和B细胞在肥胖女性中都较高。肥胖女性和非肥胖女性之间的DNA甲基化水平在细胞类型校正前后不同。校正前，观察到43， 463个不同的甲基化位置。在那之后，3， 329 CPG仍然显着。与非肥胖相比，共有162个CPG被低甲基化，576个在肥胖者中被高甲基化。这些数据可在GEO数据库中获得，注册号为GSE166611。我们介绍了与在SVD中观察到的参与者的特定特征相关的CPG站点。对于脂肪量，发现了13， 222个CPG位点。在启动子区域有6， 159个脂肪质量相关的CPG。470次甲基化和94次甲基化。相关位点的相应基因被富集，现在被显示出来。我们观察到，所提出的方案能够在您的甲基化模式中识别，并且在您的甲基化中建立联系是正确的。我们的研究结果证实，致肥胖的生活方式可以促进人类DNA的表观遗传变化。