Vi takker Claudia Corazza for hendes uvurderlige engelsksprogede støtte. Dette arbejde blev støttet af Institut for Sundhed »Carlos III« (ISCIII) under MINECO (tilskud medfinansieret af EFRU: »Una manera de hacer Europa«; Tilskud nr. PI20/01715; Pi18/00095; Pi17/01410; Pi17/01318; PI17/01237 og RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Det andalusiske regionale sundhedsministerium (tilskud nr. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; Pc-0098-2017; Pi-0075-2017; PI-0241-2016). ID er en klinisk investigator (B-0001-2017), og AA har en seniorpostdoktorkontrakt (RH-0099-2020), begge støttet af det andalusiske regionale sundhedsministerium (medfinansieret af ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Protokollens udførelse blev udført i overensstemmelse med Helsingforserklæringens principper og godkendt af den lokale etiske komité (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spanien). Alle forsøgspersoner blev informeret mundtligt om forskningsundersøgelsen, og de underskrev den tilsvarende informerede samtykkeformular.
BEMÆRK: Den nuværende protokol beskriver BAT-proceduren, som forfatterne bruger dagligt. Dette er dog ikke en standardiseret metode, og...

BAT er en supplerende in vitro-diagnostisk test til evaluering af IgE-medierede allergiske reaktioner, der har vist sig at være nyttige til diagnosticering af reaktioner induceret af forskellige udløsere såsom lægemidler, mad eller inhalanter samt i nogle former for kronisk urticaria. Generelt bør BAT-ydeevne overvejes, hvis i) allergenet / lægemidlet producerer falske positive resultater i ST; ii) allergenet /lægemidlet er ikke tilgængeligt til brug for ST- eller sIgE-kvantificering iii) der er uoverens...

IgE-medieret allergidiagnose er baseret på klinisk historie, hudtest (ST'er), kvantificering af serumspecifik IgE (sIgE) og, hvis det kræves og indikeres, kontrollerede udfordringstest (CCT'er)1,2,3,4,5,6. Klinisk historie kan dog være upålidelig, da der kan være mangel på nøjagtige oplysninger, og ST'er og CCT'er er ikke risikofrie procedurer, der kan kontraindiceres hos forsøgspersoner, der oplever alvorlige livstruende reaktioner 1,2,3,4,5,6 . Disse spørgsmål sammen med det faktum, at bestemmelsen af sIgE ved validerede og kommercielle fluor-enzymimmunoassays kun er tilgængelig for få allergener og lægemidler, har fremhævet den vigtige rolle, som andre in vitro funktionelle assays såsom basofilaktiveringstest (BAT) spiller.
Basofiler er nøgleeffektorceller involveret i IgE-medierede allergiske reaktioner, der aktiveres ved tværbinding af tilstødende sIgE bundet på højaffinitetsreceptorer (FcεRI) på celleoverfladen efter allergen / lægemiddeleksponering. Basofilaktivering udløser celledegranulering og frigivelse af præformede og nye syntetiserede inflammatoriske mediatorer indeholdt i intracytoplasmatiske sekretionsgranulater 7,8,9. BAT er en in vitro-metode, der forsøger at efterligne basofilaktiveringen i nærvær af en stimulus (allergen eller lægemiddel) og bestemmer ændringer i ekspressionen af basofile aktiveringsmarkører ved flowcytometri 7,10. Der er forskellige strategier til at identificere basofiler (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) og til at måle celleaktivering (hovedsageligt opregulering af CD63 og CD203c) ved hjælp af kombinationer af fluorokrommærkede antistoffer 7,10. CD63, den bedst klinisk validerede aktiveringsmarkør 11,12,13,14, er et membranprotein forankret i sekretorgranulatet indeholdende histamin, der efter celleaktivering og fusion af granulerne med membranen udtrykkes på basofiloverflade 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c er en overflademarkør, der konstitutivt udtrykkes på basofiler og opreguleres efter FcεRI-stimulering, som også har vist pålidelige resultater i BAT 15,22,23,24,25. Desuden ser det ud til at co-udtrykke med CD6326.
I de sidste årtier har BAT vist sig at være nyttig til diagnosticering af IgE-medierede allergiske reaktioner induceret af forskellige udløsere som lægemidler, mad eller inhalanter samt i nogle former for kronisk urticaria, som beskrevet nedenfor. Placeringen af denne teknik i de diagnostiske algoritmer er imidlertid meget variabel og ikke godt bestemt.
Overfølsomhed over for lægemidler BAT har vist sig at være nyttig som en supplerende test for udvalgte lægemidler og patienter, især for dem, der oplever alvorlige reaktioner på grund af det faktum, at diagnostisk værdi af ST ikke er veletableret for de fleste lægemidler, da de er valideret og standardiseret for et begrænset antal lægemidler27,28,29,30. Derudover er kvantificering af sIgE kun tilgængelig for et begrænset antal lægemidler med lavere følsomhed end ST 27,28,29,30,31,32. Derfor er diagnosen lægemiddeloverfølsomhed normalt afhængig af lægemiddelprovokationstest, som kan kontraindiceres hos personer, der oplever alvorlige livstruende reaktioner33.
Der er rapporteret lovende resultater for brugen af BAT hos udvalgte patienter, der rapporterer øjeblikkelige overfølsomhedsreaktioner over for forskellige lægemidler som betalactamer (BL'er)20,34,35,36,37,38,39, neuromuskulære blokeringsmidler (NMBA'er)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorquinoloner (FQ'er)46,47,48,49, pyrazoloner 50,51,52, radiokontrastmedier (RCM)53,54,55,56 og platinforbindelser57,58,59 . BAT er rapporteret at have en følsomhed og specificitet mellem henholdsvis 51,7-66,9% og 89,2-97,8%; og positive og negative prædiktive værdier er beskrevet til at ligge mellem 93,4% og 66,3%, henholdsvis27,31. Desuden er BAT blevet foreslået som en prædiktiv biomarkør for gennembrudsreaktioner under desensibilisering med platinforbindelser, da CD203c-ekspression øges sammenlignet med CD63 hos patienter med høj risiko for bivirkninger under lægemiddeldesensibilisering57.
Det er værd at bemærke, at BAT kun er nyttig ved lægemiddeloverfølsomhed, når reaktionen involverer basofildegranulering; Derfor er det ikke nyttigt i reaktioner som følge af enzymatisk hæmning af cyclooxygenase 142.
Fødevareallergi BAT er opstået som et potentielt diagnostisk værktøj til fødevareallergi, fordi bestemmelse af serum-sIgE til hele allergenekstraktet eller enkelte allergener ofte er tvetydig, hvilket kræver oral fødevareudfordring for at bekræfte diagnosen, hvilket på samme måde som lægemiddeloverfølsomhed er en dyr og ikke risikofri procedure60. Flere undersøgelser har vist relevante resultater med komælk 61,62, æg61,63, hvede 64,65,66,67,68, jordnødde 63,69,70,71,72, hasselnød 73,74,75,76 ,77, skaldyr78, fersken 79,80,81, æble21, selleri og gulerod82,83.
Den største merværdi af BAT ved diagnosticering af fødevareallergi sammenlignet med ST'er og sIgE i serum er, at det viser en højere specificitet og lignende følsomhed. BAT er således et nyttigt værktøj til at differentiere klinisk allergiske patienter fra sensibiliserede, men tolerante forsøgspersoner, der har både høj specificitet (75-100%) og følsomhed (77-98%)63,69,84. Følsomhed og specificitetsværdier afhænger af allergenet og andre faktorer som fænotyper (fx oral allergisyndrom versus anafylaksi), alder og geografirelaterede sensibiliseringsmønstre63,85.
BAT ved hjælp af enkelte allergenkomponenter kan potentielt forbedre diagnostisk nøjagtighed for nogle fødevareallergener61,80. Der er undersøgelser, der bruger frølagringsproteiner (f.eks. Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 og Ara h 6 fra jordnødder)86; lipidoverførselsproteiner (f.eks. Pru p 3 fra fersken og Ara h 9 fra jordnødder)80,86; og Bet v 1 homologer (f.eks. Ara h 8 fra peanut)87. Andre potentielle værktøjer er relateret til identifikation af synderallergenet i tilfælde af pollen-fødevareallergisyndrom 21,87,88, allergi over for rødt kød 89 eller fødevareafhængig træningsinduceret anafylaksi66.
Interessant nok kan BAT give information om sværhedsgraden og tærsklen for allergiske reaktioner, da patienter med mere alvorlige reaktioner viser en større andel af aktiverede basofiler, som observeret i undersøgelser af jordnødde- og komælkallergiske patienter 84,90,91; og patienter, der reagerer på spormængder af allergenet, viser en større basofilfølsomhed 84,90,92. Disse data tyder på, at BAT kan være nyttigt til at identificere allergiske højrisikopatienter, der kræver tættere opfølgning og mere intensiveret uddannelse93. Desuden er det blevet rapporteret, at BAT kan forudsige fødevareudfordringsrespons 70,91,92,94 og tærskler for reaktivitet90,95 for at hjælpe med at bestemme, hvornår fødevarer sikkert kan (gen)indføres 84. Disse resultater er imidlertid kontroversielle i nogle undersøgelser63,96 og mere forskning er påkrævet.
På den anden side er BAT blevet brugt til at overvåge opløsningen af fødevareallergi, enten naturligt eller under immunmodulerende behandlinger, over tid, som indtil nu kun er blevet vurderet ved oral fødevareudfordring med de tilknyttede risici og omkostninger 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Desuden er det også blevet brugt til at overvåge effekten af omalizumab i fødevareallergi, da basofilaktivering falder under behandling med omalizumab, men det stiger efter ophør af behandling109.
Inhalationsallergi BAT er sjældent gavnligt ved inhalationsallergi, da diagnosen rutinemæssigt kan etableres ved sIgE-kvantificering og ST. I tilfælde af lokal allergisk rhinitis (uopdagelige niveauer af sIgE og negative ST'er med positive nasale provokationstest) har BAT imidlertid tilladt diagnose i 50% af tilfældene110. Det er yderligere rapporteret en sammenhæng mellem basofilfølsomhed og respons på nasale / bronchiale provokationstest samt mellem astma sværhedsgrad og effekt af behandling med omalizumab111,112.
BAT er også blevet brugt til at overvåge allergenimmunterapi for husstøvmide og pollen, da basofilfølsomheden falder under immunterapi, sandsynligvis på grund af interferens med blokerende IgG-antistoffer 113,114,115,116,117.
Hymenopteragift allergi Diagnose af hymenoptera giftallergi er rutinemæssigt baseret på ST og serum sIgE. BAT har vist en høj følsomhed (85-100%) og specificitet (83-100%), og det er blevet rapporteret at være nyttigt i tilfælde, der giver tvetydige resultater eller hos patienter med en suggestiv klinisk historie med giftallergi, men uopdagelig sIgE og negativ ST118,119. BAT ser imidlertid ikke ud til at forudsige sværhedsgraden for disse reaktioner120.121.
Op til 60% af patienterne udviser sIgE til både hvepse- og bigift, og identifikation af dominerende allergen er afgørende for tilstrækkelig immunterapibehandling. I disse tilfælde er BAT rapporteret at være nyttig til identifikation af det dominerende allergen 119,122,123,124. Selvom sIgE til de vigtigste allergener af bi- og hvepsegifte kan reducere nytten af BAT hos patienter med dobbelt positivitet over for begge gifte, giver det nyttig information hovedsageligt hos forsøgspersoner med negative resultater i sIgE-bestemmelse123.
Nogle undersøgelser tyder på, at BAT kan være nyttig som en prædiktiv biomarkør for bivirkninger i opbygningsfasen af giftimmunterapi, da denne behandlingsmulighed er rapporteret at reducere basofilfølsomheden. Reaktiviteten falder dog ikke, og dette BAT-værktøj er i dag kontroversielt 13.120.125.126.127.128.129.130.
Urticaria og angioødem En delmængde af kroniske urticaria-patienter har en autoinmune patofysiologi på grund af IgE-autoantistoffer mod autoallergener og IgG-autoantistoffer, der er målrettet mod FcεRI- eller IgE-FcεRI-komplekser, der er til stede på mastcelleoverfladen131.132. I klinisk praksis har diagnosen af denne type kronisk urticaria været afhængig af positiv autolog serum ST, som har risiko for utilsigtet infektion. BAT er blevet foreslået som en in vitro-test til diagnosticering og overvågning af patienter med mistanke om kronisk urticaria. Både CD63- og CD203c-ekspression på overfladen af basofiler er rapporteret at være øget efter stimulering med sera fra kroniske urticaria-patienter, hvilket viser påvisning af aktive autoantistoffer 133,134,135,136,137. For nylig er det blevet rapporteret, at patienter med positiv BAT ofte oplever den mest aktive sygdomstilstand, vurderet ud fra urticaria-aktivitetsscore, og kræver højere doser antihistaminer sammen med tredjelinjebehandlinger (cyclosporin A eller omalizumab) sammenlignet med dem med negativ BAT138.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>310708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>353006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution 10x concentrated</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse Anti-Human IgE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>203-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUBE 9 mL LH Lithium Heparin</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>455084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

basophil activation test for allergy diagnosis

Basofilaktiveringstesten (BAT) er en supplerende in vitro-diagnostisk test, der kan bruges ud over klinisk historie, hudtest (ST) og specifik IgE (sIgE) bestemmelse ved evaluering af IgE-medierede allergiske reaktioner på mad, insektgift, lægemidler samt nogle former for kronisk urticaria. Imidlertid er denne tekniks rolle i de diagnostiske algoritmer meget variabel og ikke godt bestemt.
BAT er baseret på bestemmelse af basofilrespons på allergen/lægemiddel-tværbindende IgE-aktivering gennem måling af aktiveringsmarkører (såsom CD63, CD203c) ved flowcytometri. Denne test kan være et nyttigt og komplementært værktøj til at undgå kontrollerede udfordringstest for at bekræfte allergidiagnose, især hos personer, der oplever alvorlige livstruende reaktioner. Generelt bør udførelsen af BAT overvejes, hvis i) allergenet / lægemidlet producerer falske positive resultater i ST; ii) der er ingen allergen / lægemiddelkilde til brug for ST- eller sIgE-bestemmelse; iii) der er uoverensstemmelse mellem patienthistorie og ST- eller sIgE-bestemmelse iv) symptomer tyder på, at ST kan resultere i systemisk respons; v) før du overvejer en CCT for at bekræfte synderallergenet / lægemidlet. Testens vigtigste begrænsninger er relateret til ikke-optimal følsomhed, især i lægemiddelallergi, behovet for at udføre testen ikke længere end 24 timer efter prøveekstraktion og manglen på standardisering mellem laboratorier med hensyn til procedurer, koncentrationer og cellemarkører.

BAT udført med allergener eller lægemidler tillader undersøgelse af IgE-afhængige overfølsomhedsreaktioner. Basofilreaktivitet skal måles i mindst to optimale koncentrationer for at opnå de bedste resultater34 , og aktivering visualiseres ved opregulering af CD63 på celleoverfladen. I tilfælde af allergener skal basofilfølsomheden desuden analyseres ved at måle reaktiviteten ved flere faldende allergenkoncentrationer114 for at bekræfte basofilreaktiviteten. Denn...

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis at JoVE.com

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

Basofilaktiveringstesten er en supplerende in vitro-diagnostisk test til evaluering af IgE-medierede allergiske reaktioner baseret på påvisning af basofilaktivering i nærvær af en specifik stimulus gennem måling af aktiveringsmarkører ved flowcytometri.

Basophil aktiveringstest til allergidiagnose

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

Basofilaktiveringstesten er en gratis in vitro-diagnostisk test til evaluering af IgE-medierede allergiske reaktioner, der har vist sig at være nyttige til reaktioner induceret af lægemidler, mad eller inhalanter samt i nogle former for kronisk urticaria. Denne test er baseret på bestemmelse af basofilrespons på et allergen eller lægemiddel, der tværbinder IgE-aktivering gennem måling af aktiveringsmarkører ved flowcytometri. Basofilaktiveringstesten kan være et nyttigt og gratis værktøj til at undgå kontrollerede udfordringstest for at bekræfte allergidiagnosen, især hos personer, der oplever alvorlige livstruende reaktioner.Desuden har denne test den fordel, at den er i stand til at analysere responsen mod ethvert lægemiddel eller allergen sammenlignet med andre in vitro-metoder, der kun er tilgængelige for nogle få lægemidler og allergener. Testens vigtigste begrænsninger er relateret til ikke-optimal følsomhed, især i lægemiddelallergi. Behovet for at udføre testen ikke længere end 24 timer efter prøveekstraktion og manglen på standardisering mellem laboratorier og diagnostiske algoritmer.Begynd med at indsamle perifert blod i ni milliliter hepariniserede rør, og læg prøverne i en rotor for at opretholde dem ved stuetemperatur, indtil de er nødvendige for den eksperimentelle protokol. Mærk to fem milliliter cytometerrør hver for negativ kontrol og positiv kontrol. Mærk også et rør hver for de forskellige allergen- eller lægemiddelkoncentrationer, der testes.Placer derefter rørene i et stativ, så rørene passer perfekt uden at glide. For den første positive kontrol fremstilles en fire mikromolær opløsning af N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin eller fMLP i 0,05% PBS-T For at bekræfte kvaliteten af basofiler. Til den anden positive kontrol fremstilles en 0,05 milligram pr. milliliter anti-IgE-opløsning ved hjælp af PBS-T.Forbered farvningsblandingen ved at tilføje en mikroliter hver af CCR3-APC-, CD203c-PE- og CD63-FITC-antistoffer pr. 20 mikroliter stimuleringsbuffer. Tilsæt derefter 23 mikroliter af denne farvningsblanding til hvert rør. Tilsæt 100 mikroliter PBS-T til de negative kontrolrør.Tilsæt 100 mikroliter fMLP til et af de positive kontrolrør og tilsæt 100 mikroliter anti-IgE til det andet til resten af rørene. Tilsæt 100 mikroliter af de forskellige allergen- eller lægemiddelkoncentrationer og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Efter inkubation tilsættes 100 mikroliter blod forsigtigt til hvert rør for at undgå hæmolyse.Derefter hvirvles forsigtigt rørene og inkuberes dem i 25 minutter ved 37 grader Celsius i det termostatiske bad med medium omrøring. Hold rørene ved fire grader Celsius i mindst fem minutter for at stoppe degranuleringen. Til hvert rør tilsættes to milliliter lysbuffer for at lyse erythrocytterne.Hvirvel hvert rør og inkuber derefter rørene i fem minutter ved stuetemperatur. Centrifuge rørene ved 300 g ved fire grader Celsius i fem minutter. Vend derefter stativet i vasken for at dekantere supernatanten, mens cellerne forbliver i bunden af rørene.Tilsæt tre milliliter PBS-T til hvert rør for at vaske cellerne og hvirvle rørene. Udfør en anden runde centrifugering ved hjælp af det samme sæt parametre, og dekanter supernatanten ved at vælte stativet i vasken. Hold derefter prøverne ved fire grader Celsius beskyttet mod lys indtil flowcytometri.Tilslut flowcytometeret til computersoftwaren, og vent, indtil cytometeret er klar. Indlæs skabelon- og instrumentindstillingerne som beskrevet i tekstmanuskriptet. Start processen med prøveopkøb.For at vælge aktiverede basofiler skal du først gate lymfocytterne fra Side Scatter-Forward Scatter-plottet. Derefter gate basofilerne fra lymfocytpopulationen som CCR3 + CD203c + celler og erhverve mindst 500 basofiler pr. Rør. Indstil CD63-tærsklen til ca. 2,5% ved hjælp af de negative kontrolrør og analyser prøverne.IgE-afhængige overfølsomhedsreaktioner blev undersøgt ved at udføre en basofilaktiveringstest eller BAT ved hjælp af allergener og lægemidler. Basofilfølsomhed blev analyseret ved at måle reaktiviteten ved flere faldende allergenkoncentrationer, der hjælper med at bestemme den allergiske koncentration, der inducerer responsen fra 50% basofiler eller EC50. For det første blev lymfocytter gated fra siden scatter-forward scatter plot.Derefter blev basofiler indhegnet fra lymfocytpopulationen som CCR3 + CD203c + celler. Derefter blev et CCR3-CD63-plot brugt til at analysere basofilaktivering ved hjælp af CD63 som en aktiveringsmarkør for to lægemidler og forskellige koncentrationer af et allergen. Testen udføres med frisk fuldblod og må udføres højst 24 timer efter blodekstraktion.Den stimulus, der anvendes i testen, bør ikke omfatte hjælpestoffer, og lægemidlets kemiske egenskaber skal overvejes. Andre yderligere in vitro-metoder til diagnosticering af IgE-medierede allergiske reaktioner eller bestemmelse af sIgE eller histaminfrigivelsestesten.